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Neue Wege zur rekombinanten Oligomerisierung von Peptiden und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9-Komplex

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Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war der Aufbau und die Etablierung eines rekombinanten Oligomerisierungsverfahrens von Peptiden und kleinen Proteinen über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex. Das System sollte in Hinsicht auf die Generierung bispezifischer Oligomere, der Oligomerisierung von Proteinen, der Bindung und Modulation pharmazeutisch relevanter Rezeptoren und der chemischen Funktionalisierung untersucht werden. Im ersten Abschnitt der Arbeit erfolgte der Aufbau eines robusten Expressionsystems zur Bereitstellung funktionaliserter Tim10/9‐Komplexe. Es war möglich sowohl ein bicistronisches als auch ein duales Expressionssystem zu etablieren. Beide Systeme stellten funktionalisierte Tim10/Tim9‐Komplexe für weitere Analysen in ausreichender Mengen bereit. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Integrität der hexameren Struktur bei N‐ oder C‐terminaler Fusion einer Passagierdomäne an die Tim9‐ oder Tim10‐Untereinheit erhalten bleibt. Der zweite Abschnitt beschäftigte sich mit der Generierung biofunktionaler Tim10/Tim9‐Komplexe. Dabei war es möglich sowohl pseudozyklische Peptide, als auch Cystin‐Knoten‐Mikroproteine über Fusion an den Tim10/Tim9‐Komplex zu oligomeriseren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Oligomeriserung eines VEGFR‐2 spezifischen Bindepeptids über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex eine höhere Affinität gegenüber dem Rezeptor erreicht werden kann. Zudem war es durch die Kombination ErbB2‐ und VEGFR‐2‐bindender Tim10/Tim9‐Komplexe möglich eine bispezifische Variante herzustellen. Bei der Inhibition beider Signaltransduktionswege konnte in verschiedenen Arbeiten ein synergistischer Effekt in Bezug auf die Supression von Tumorwachstum erzielt werden. Als Vertreter der Proteinfamilie konnten hinsichtlich ihrer Faltung komplexe Cystin‐Knoten‐Mikroproteine oligomerisiert werden. Die verwendete Variante ET‐TP‐020 stimulierte in oligomeriserter Form die Proliferation von M‐07e Zellen (humane Megakaryoblasten). Die Stimulation der Zellproliferation setzt eine Darreichung des Bindeproteins in oligomerer Form voraus. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die in dieser Arbeit generierten Komplexe auch im zellulären Kontext eine oligomerisierungsabhängige Aktivität aufweisen. Im letzten Abschnitt wurde die Möglichkeit der spezifischen chemischen Funktionalisierung untersucht. Dabei konnte ein Verfahren aufgebaut werden, das durch Oxidation des durch Spaltung mit TEV‐Protease erhaltenen N‐terminalen Serins zu einer Aldehydfunktion eine spezifische Kopplung von Hydrazid‐ oder Thiosemicarbazidderivaten ermöglicht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kopplung eines Fluorescein‐5‐Thiosemicarbazids spezifisch an die Tim10‐Untereinheit erfolgt und die Integrität des Tim10/Tim9‐Komplexes erhalten bleibt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine rekombinante Oligomeriserung pharmazeutisch relevanter Peptide und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex möglich ist und die Oligomeriserung zu einer besseren Affinität konjugierter Peptide führen kann. Das hier vorgestellte System ermöglicht zudem eine gerichtete chemische Funktionalisierung bereits rekombinant funktionalisierter mitochondrialer Tim10/Tim9‐Komplexe.

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