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Herstellung und Charakterisierung von Umweltgenbanken aus Böden zur Aufklärung von genetischen und physiologischen Eigenschaften nicht-kultivierter Crenarchaeota

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Technische Universität
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Abstract

Mit Hilfe von 16S rDNA Analysen wurde eine neue Gruppe von Archaea, die sogenannten mesophilen Crenarchaeota, in verschiedenen marinen und terrestrischen Ökosystemen nachgewiesen. Da kein Vertreter dieser Gruppe bisher im Labor kultiviert werden konnte, sind diese Organismen noch sehr wenig charakterisiert. In dieser Arbeit wurden Genbanken mit großen klonierten DNA-Fragmenten aus verschiedenen Bodenproben angelegt, um eine Voraussetzung für das Studium der mesophilen Crenarchaeota und anderer nicht-kultivierter Mikroorganismen aus Böden zu schaffen. Dafür wurde hochmolekulare DNA aus einem nährstoffarmen Sandökosystem (RUD) isoliert und von Huminsäuren gereinigt. Zusammen mit zwei weiteren Boden-DNAs, aus einem Graslandboden und einem Mischwaldboden, wurde diese in Fosmid-Genbanken abgelegt, die insgesamt 2,5 Gbp klonierter Umwelt-DNA enthielten. Die Charakterisierung von zwei der Genbanken und einer weiteren von RUD vorhandenen wurde durch die Erstellung von randständigen Sequenzen (je Seite >700 bp) von 2.688 zufällig ausgewählten Fosmiden möglich. Die Auswertung der 5.376 Sequenzen im Umfang von insgesamt mehr als 4 Mbp zeigten, dass 1.) 56% aller Sequenzen keine Ähnlichkeiten mit Genen aus den Datenbanken aufwiesen; dass 2.) 42% der Sequenzen Ähnlichkeiten mit bakteriellen, und nur je ca. 1% mit archaealen und eukaryontischen Genen hatten; dass 3.) Protein-kodierende Gene ähnlich auf funktionelle Kategorien (COG-Kategorien) verteilt waren wie in kompletten Genomen kultivierter Mikroorganismen; dass 4.) eine große Diversität an mikrobiellen Genomen vertreten war; und dass 5.) basierend auf G+C-Gehalt und Auswertung der Treffer mit größten Ähnlichkeiten, deutliche Unterschiede zwischen den Banken in Bezug auf Herkunft und Art der Präparation der DNA zu beobachten waren. Auswertungen phylogenetischer Markergene in den Endsequenzen ermöglichten die Zuordnung von Genomfragmenten zu spezifischen phylogenetischen Gruppen. Neben einem, über ein kodiertes 16S rRNA-Gen identifiziertes Fosmid, konnten so anhand der Endsequenzen mindestens sieben weitere Fosmide nicht-kultivierten Crenarchaeota zugeordnet werden. Von drei crenarchaealen Fosmiden wurden die Sequenzen bestimmt und detailliert ausgewertet: Klon 6a13 wurde anhand eines potentiellen archaealen cdc48-Gens identifiziert, Klon 68f19 durch ein randständiges Chaperonin-Gen und Klon 54d9 durch ein rRNA-Operon. In der insgesamt 114 kb umfassenden Sequenzinformation wurden 114 offene Leserahmen gefunden. Neben Genen die für an zentralen zellulären Prozessen beteiligte Proteine kodierten, wurden auch Gene gefunden, die Hinweise auf spezielle Stoffwechselwege gaben. Besonders eine neuartige, vermutliche dissimilatorische Kupfer-enthaltende Nitritreduktase (NirK), die einzigartig durch ein C-terminal fusioniertes Amicyanin war, deutete darauf hin, dass Crenarchaeota in Böden denitrifizieren könnten. Die biochemische Bestätigung der Aktivität dieses Enzyms wurde durch Herstellung von Gen-Konstrukten mit und ohne Leserahmen für die Amicyanin-Domäne vorbereitet. Diese Konstrukte wurden heterolog im Cytoplasma und Periplasma von Escherichia coli exprimiert und die erhaltenen Proteine für Aktivierungs- und Rückfaltungsversuche verwendet. Zwei weitere gefundene Gene kodierten potentielle Proteine, die schwache Ähnlichkeiten mit Ammonium- bzw. Methan-Monooxygenasen (AmoA/PmoA) aufwiesen. In bioinformatischen Analysen konnte sowohl eine weite Verbreitung des vermutlichen amoA Gens bei mesophilen Crenarchaeota aufgezeigt werden, als auch eine strukturelle Ähnlichkeit des Proteins mit AmoA Proteinen bekannter Nitrifizierer. Anhand der gewonnenen Erkenntnisse wurde abschließend eine Hypothese über die Physiologie der nicht-kultivierten Crenarchaeota aufgestellt.

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