Affordable Access

Heterologous production, characterization and isolation of selected G protein-coupled receptors for structural studies

Authors
Publication Date
Keywords
  • Ddc:540

Abstract

Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie der Zelloberflächenrezeptoren dar. 1-5% des Wirbeltiergenoms kodiert für diese Rezeptorfamilie. Im Humangenom sind etwa 800-1000 Gene vertreten, die für GPCRs kodieren. Trotz der großen Unterschiede in ihrer Sequenz und Aktivierung haben alle GPCRs zwei Gemeinsamkeiten: (1) Ihre Architektur wird durch sieben Transmembranhelices beschrieben. (2) Ihre Funktion in der Signaltransduktion üben alle durch Aktivierung der heterotrimeren Guanylnukleotid-Bindeproteine (GProteine) aus. Die GPCRs sind an der Regulierung einer Vielzahl von physiologischen Prozessen beteiligt und stellen daher wichtige Ziele für die Medikamentenentwicklung dar. Bisher gibt es kaum Möglichkeiten zur strukturbasierenden Medikamentenentwicklung, da, bis auf das Rinder-Rhodopsin, nur sehr wenige Informationen zur dreidimensionalen Struktur von GPCRs verfügbar sind. Das Rinder-Rhodopsin nimmt allerdings unter den GPCRs eine Sonderstellung ein. Im Gegensatz zu allen übrigen GPCRs bindet es seinen Liganden, 11-cis Retinal, kovalent und liegt dann in der nicht-aktivierten Form vor. Zudem kann Rhodopsin in großen Mengen aus Rinderretina isoliert werden, wohingegen die übrigen GPCRs nur in geringen Mengen in ihren natürlichen Geweben vorkommen. Die vorliegende Arbeit verfolgt drei Ziele: Erstens sollen GPCRs durch heterologe Expression in hohen Ausbeuten hergestellt und biochemisch charakterisiert werden. Die Etablierung eines Solubilisierungs- und Aufreinigungsprotokolls stellt das zweite Ziel dar. Drittens soll die Interaktion von Ligand und Rezeptor mittels verschiedener Techniken untersucht werden. Grund für die erste Zielsetzung ist die geringe Verfügbarkeit reinen, homogenen und stabilen Proteins im Milligramm-Maßstab, welches die größte Hürde für strukturelle Untersuchungen von GPCRs darstellt. Hier wurden verschiedene Expressionssysteme zur heterologen Produktion von Membranproteinen etabliert. Die Wahl des Expressionssystems ist hierbei entscheidend, um posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierung sowie die korrekte Faltung des Rezeptors zu gewährleisten. Neben E. coli haben sich hierbei vor allem eukaryotische Expressionssystems wie Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit wurden drei GPCRs hergestellt und analysiert: der humane Bradykinin Rezeptor Typ 2 (B2R), der humane Angiotensin II Rezeptor Typ 1 (AT1aR) und der humane Neuromedin U Rezeptor Typ 2 (NmU2R). Diese drei Rezeptoren wurden in drei Expressionsystemen (Pichia pastoris, Insektenzellen und Säugerzellen) heterolog produziert und biochemisch charakterisiert. Für jedes der drei Proteine wurden Solubilisierungs- und Aufreinigungsprotokolle etabliert. Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend für Kristallisationsexperimente, für Festkörper NMR Untersuchungen und weitere Experimente eingesetzt. Der erste untersuchte Rezeptor, B2R, kann vor allem in Endothelzellen, vaskulären glatten Muskelzellen und Kardiomyozyten nachgewiesen werden. Seine Aktivierung spielt bei der Entstehung von Entzündungen, Schmerz, Gewebsverletzung sowie herzschützenden Mechanismen eine Rolle. Im Rahmen der Doktorarbeit wurde B2R in der Hefe Pichia pastoris (3,5 pmol/mg), in BHK-Zellen (10 pmol/mg) und in Sf9-Zellen (60 pmol/mg) erfolgreich rekombinant produziert. Zur Charakterisierung wurde die Bindung des Liganden [3H] Bradykinin, die GProtein- Kopplung, zelluläre Lokalisierung sowie die Glykosylierung des Rezeptors untersucht. Der heterolog produzierte Rezeptor konnte in hoher Reinheit isoliert werden. Homogenität und Stabilität des aufgereinigten Proteins wurden mittels Gelfiltration analysiert. Aus BHK und Sf9 Zellen konnten Milligramm-Mengen reinen und stabilen Rezeptors isoliert werden, die zu Kristallisationsexperimenten verwendet wurden. Hier zeigten sich kristallartige Strukturen, die zur Zeit weiter charakterisiert werden. Der zweite untersuchte Rezeptor, AT1aR, kann in glatten Muskelzellen, Leber, Nieren, Herz, Lunge und Hoden nachgewiesen werden. Die Aktivierung dieses Rezeptors spielt eine Rolle bei der Regulation des Blutdrucks und bei cardiovaskulären Erkrankungen. Rekombinanter AT1aR konnte mit hoher Ausbeute (167 pmol/mg) in Pichia pastoris hergestellt werden. Die Ausbeute bei Produktion in Insektenzellen (29 pmol/mg) und Säugerzellen (32 pmol/mg) lag im mittleren Bereich. Der rekombinante Rezeptor wurde hinsichtlich der Bindung von [3H] Angiotensin II, der zellulären Lokalisierung und Glykosylierung charakterisiert. Im Anschluss wurde er erfolgreich mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Homogenität und Stabilität des gereinigten AT1aR wurden mittels Gelfiltration analysiert. Aus Pichia pastoris konnte das Protein im Milligramm-Maßstab isoliert werden, so dass Kristallisationsexperimente möglich waren. Dem dritten Rezeptor, NmU2R, konnte erst kürzlich sein Ligand, Neuromedin U, zugeordnet werden. Der Rezeptor ist im zentralen Nervensystem, und hier insbesondere in der Medulla oblongata, dem Rückenmark und dem Thalamus lokalisiert. Aufgrund dieser Verteilung wird angenommen, dass er eine Rolle in der Regulation der Weiterleitung sensorischer Nervenimpulse sowie deren Modulation spielt. Während meiner Arbeit konnte ich bei der heterologen Produktion des Rezeptors Ausbeuten von 6 pmol/mg in Pichia pastoris und 9 pmol/mg in BHK Zellen erzielen. Der rekombinante Rezeptor wurde mittels Bindung eines Radioliganden ([125I] NmU) charakterisiert. Weiterhin wurde die zellulärer Lokalisierung und Glykosylierung des GPCRs untersucht. Obwohl der rekombinante NmU2R erfolgreich isoliert werden konnte, sind auf Grund der geringen Produktionsmengen zur Zeit keine Struktur untersuchungen möglich. Zur Analyse der pharmakologisch wichtigen Ligand-Rezeptor- Wechselwirkung wurde Festkörper NMR Spektroskopie eingesetzt. Durch die Verwendung von selektiv mit 13C und 15N markierten Peptiden können Konformationsänderung des Peptidliganden beim Binden des Rezeptors untersucht werden. Die Bestimmung der genauen Konformation des gebunden Liganden ist für die Medikamentenentwicklung von Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels der Festkörper NMR Spektroskopie die Konformation des rezeptorgebunden Liganden, Bradykinin, untersucht. Die ersten Ergebnisse weisen auf signifikante Strukturänderungen Bradykinins hin, sobald es an den B2R bindet. Untersuchungen bezüglich Wechselwirkung von GPCRs mit anderen Protein sind auch für die Kristallisation relevant. Eine der Herausforderungen in der Kristallisation von GPCRs ist die kleine hydrophile Oberfläche, die zur Bildung von Kristallkontakten im Kristallgitter oft nicht ausreichend ist. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, ist die Bildung eines stabilen Komplexes aus dem Rezeptor und einem interagierenden Protein. Zusätzlich kann der Rezeptor durch die Interaktion in eine weniger flexible Form überführt werden, was die Kristallisation und die spätere Strukturbestimmung erleichtern kann. Basierend auf diesem Ansatz wurden B2R und AT1aR, die einen stabilen heterodimeren Komplex bilden, in BHK Zellen ko-exprimiert. Bemerkenswert war hierbei dass B2R im Komplex mit AT1aR in der Plasmamembran vorzufinden war, während B2R alleine hauptsachlich in intrazellulären Membranen exprimiert wurde. Weiterhin führte die Koexpression der beiden Rezeptoren zu einem vierfachen Anstieg der [3H] Bradykinin Bindungsstellen auf der Zelloberfläche. Es konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass nach der Stimulation mit nur einem der beiden rezeptorspezifischen Liganden beide GPCRs zusammen internalisiert wurden. Dieses Phänomen wurde auch in menschlichen Vorhaut- fibroblasten nachgewiesen, in denen beide Rezeptoren vorkommen. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass auch in nativen Geweben die Anwesenheit des AT1aR für die Expression und den Transfer des B2R zur Plasmamembran nötig ist. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass Heterodimerisierung eine Voraussetzung für die Zelloberflächenlokalisierung bestimmter GPCRs ist. Der Ko-Komplex aus B2R und AT1aR konnte mittels dualer Affinitätschromatographie isoliert, wie durch SDS-PAGE Analyse, analytische Gelfiltration und Bindung von Radioliganden gezeigt werden konnte. „Pull-down“ Experimente, die drei Tage nach der Reinigung durchgeführt wurden, wiesen darauf hin, dass der Ko-Komplex nicht stabil war und zerfiel. Bei der Reinigung von Membranproteinen verursacht der Verlust von Lipiden während des Isolationsprozeßes oft eine Beeinträchtigung der Stabilität des Proteins. Auch das verwendete Detergenz beeinflusst die Stabilität von Membranproteinen. Experimente zur Verbesserung der Langzeitstabilität des Komplexes durch Zugabe von Lipiden und anderen Detergenzien sind in Vorbereitung. Die Bildung von Ko-Komplexen wurde zusätzlich mit Beta-Arrestin, einem Inhibitor der Kopplung von G-Proteinen und ihren Rezeptoren untersucht. Beta- Arrestin ist ein zytosolisches Protein, dass an der Desensibilisierung der Agoniststimulierten GPCRs beteiligt ist. Versuche, eine Ko-Komplexbildung aus gereinigtem B2R und gereinigtem Beta-Arrestin in vitro zu erzielen, schlugen fehl. In „Pull-Down“ Experimenten konnte keine Interaktion nachweisen werden. Wurde anstatt des nativen B2R eine C-terminale Mutante, bei welcher der C-Terminus des B2R gegen den des Vasopressinrezeptors ausgetauscht worden war, verwendet, konnte in vitro Ko- Komplexbildung mit Beta-Arrestin festgestellt werden. Mit Experimenten zur Bestimmung der Langzeitstabilität des Ko-Komplexes sowie zur Ko-Kristallisations wurde begonnen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Produktion, Charakterisierung und Aufreinigung von drei rekombinanten humanen GPCRs etabliert. Die rekombinanten Rezeptoren wurden im Milligramm-Maßstab produziert. Damit ist die erste, wesentliche Hürde zur Strukturanalyse genommen. Der B2R-β-Arrestin Komplex kann sich als vorteilhaft für die Kristallisation herausstellen. Zusätzlich konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der Transfer eines GPCRs an die Zelloberfläche von der Heterodimerisierung mit einem anderen nicht-verwandten GPCR abhängig sein kann.

There are no comments yet on this publication. Be the first to share your thoughts.