Etude de la transcétolase de Geobacillus stearothermophilus et modification de son énantiosélectivité par ingénierie enzymatique

La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d aldéhydes a-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d une liaison C-C. L objectif de ces travaux est d inverser l énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d aldéhydes a-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d abord été identifiée et produite. L étude de sa structure tridimensionnelle a permis d identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d identifier les mTKgst mutées d intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d un facteur 5 par rapport à l enzyme sauvage et la perte de l énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée. / Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) catalyzes the formation of D-threo ketoses from (2R)-a-hydroxyaldehydes by the stereospecific formation of a C-C bond. Our aim was to invert the enantioselectivity of TK by protein engineering in order to obtain L-erytho ketoses (sought after for their potential pharmaceutical and/or nutritional applications) from (2S)-a-hydroxyaldehydes. For that purpose, a thermostable TK from thermophilic bacterium Geobacillus stearothermophilus (mTKgst) has been identified and overexpressed. After the study of the 3D-structure of mTKgst, two residues located in its active site (Leu382 and Asp470) were selected as mutation targets for the inversion of the enzyme s enantioselectivity. Both rational and semi-rational approaches were considered for the construction of the mutant mTKgst libraries. In the former, the two residues were modified by site-saturation mutagenesis. In the latter, short sequences of five amino acids, neighboring target ones, were modified using a cassette mutagenesis technique. A novel continuous pH-based assay has been developed for the high-throughput screening of the mTKgst libraries, using phenol red as pH indicator. The screening revealed mTKgst-L382D/D470S as the top mutant, showing a 5-fold activity improvement towards a model (2S)-hydroxyaldehyde and the loss of enantioselectivity towards the (2R)-aldehyde. / CLERMONT FD-Bib.électronique (631139902) / Sudoc / Sudoc / France / FR