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Développement de nouveaux biosenseurs fluorescents pour l'étude dynamique de la signalisation purinergique

Authors
  • Ollivier, Matthias
Publication Date
Oct 12, 2018
Source
HAL-UPMC
Keywords
Language
French
License
Unknown
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Abstract

En dehors de son rôle de stockage de l’énergie cellulaire, l’adénosine-triphosphate (ATP) est également une molécule de signalisation extracellulaire qui agit sur deux familles de récepteurs, les récepteurs métabotropiques P2Y et les récepteurs ionotropiques P2X. Dans le système nerveux central, les récepteurs P2X et la signalisation purinergique sont impliqués dans de nombreuses fonctions physiologiques comme la modulation de la transmission synaptique et la communication neurone-glie ainsi que dans diverses pathologies telles que les douleurs chroniques, l’épilepsie ou les maladies neurodégénératives. Enregistrer l’activité des récepteurs P2X in situ reste aujourd’hui encore difficile de par la paucité des outils pharmacologiques et de par les propriétés biophysiques particulières de ces récepteurs canaux. De surcroit, les mécanismes de libération de l’ATP sont encore mal caractérisés et la détection de cette molécule dans l’espace extracellulaire est limitée par la faible résolution spatio-temporelle des techniques disponibles. A ce jour, il n’existe aucune méthode satisfaisante permettant de suivre l’activité des récepteurs P2X ou détecter la libération d’ATP en temps réel. Pour pallier à ces manques, nous avons développé de nouveaux outils fluorescents basés sur la fusion du rapporteur calcique GCaMP6s aux récepteurs P2X.Notre étude montre d’abord que ces biosenseurs P2X-GCaMP6s sont capables de rapporter spécifiquement et dynamiquement, en fluorescence, l’activité des récepteurs P2X dans différentes lignées cellulaires (HEK, astrocytes, macrophages), ainsi que dans des neurones hippocampiques en culture. Dans un deuxième temps, l’outil P2X2-GCaMP6s a été modifié afin de créer un biosenseur de haute affinité pour l’ATP extracellulaire. Deux mutants, dont l’affinité apparente est de l’ordre de la centaine de nanomolaire, ont permis de détecter et de quantifier une libération d’ATP endogène. En combinant l’utilisation de ces biosenseurs avec des approches pharmacologiques et génétiques, nous avons montré que lors d’un choc hypotonique l’activation du canal VRAC LRRC8 contribue à la libération d’ATP par les cellules HEK et par des monocytes humains différenciés en macrophages. Enfin, nous avons montré que la libération d’ATP lors du gonflement des cellules déclenchait le phénomène de régulation du volume cellulaire, permettant aux cellules de retrouver leur volume initial.Ces biosenseurs fluorescents permettent donc de visualiser de façon dynamique l’activité des récepteurs P2X et la libération d’ATP. Ces outils étant compatibles avec des approches in vivo, ils devraient permettre une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires de la communication purinergique.

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