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Molekulare und funktionelle Analyse von P-Typ-Kalzium-ATPasen im Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G.

Authors
Publisher
Universität Freiburg
Publication Date
Keywords
  • Calcium
  • P-Typ-Atpasen
  • Calcium-Atpasen
  • Physcomitrella Patens
  • Laubmoose
  • Saccharomyces Cerevisiae
  • Pumpe
  • Calcium
  • P-Type-Atpase
  • Calcium Pump
  • Yeast
  • Life Sciences

Abstract

Das Laubmoos Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. diente in der vorliegenden Arbeit als Modellsystem zur Untersuchung von P-Typ-Kalzium-ATPasen und ihrem Einfluss bei der Entwicklung von Pflanzen. Diese auch als Kalziumpumpen bezeichneten Proteine sind in den letzten Jahren in Tieren und Höheren Pflanzen näher charakterisiert worden. Aus Niederen Pflanzen lagen bisher keine Daten für Vertreter der autoinhibitorischen P2B-Kalzium-ATPasen vor. In EST-Datenbanken wurden drei Homologe von Physcomitrella-Ca2+-ATPasen (PCA) identifiziert. Die vollständigen codierenden Sequenzen von zwei der drei Gene, pca1 und pca2, konnten dabei durch 5’-RACE-PCR und durch Datenbankanalysen identifiziert werden. Der Vergleich der Aminosäuresequenzen mit Mitgliedern von Ca2+-ATPasen aus Höheren Pflanzen mittels Stammbaum- und Motivanalysen bekräftigte die Einordnung von PCA1 und PCA2 in die Gruppe der P2B-Kalzium-ATPasen. Die Berechnung der dreidimensionalen Struktur der beiden Proteine erfolgte durch Vergleich mit der bekannten Struktur von Oc-SerCa1, einer P2A-Kalzium-ATPase aus Kaninchen. Dabei wurden Modelle von PCA1 und 2 mit vergleichbarer 3D-Struktur erstellt. Die Bestimmung der genomischen Sequenz von pca1 zeigte, dass der Aufbau des Gens nahezu unverändert in vergleichbaren Genen von Arabidopsis thaliana vorhanden ist. Durch Expression eines pca1::gfp-Fusionsgens wurde PCA1 in Protoplasten von Physcomitrella lokalisiert. Das Fusionsprotein konnte in Strukturen nachgewiesen werden, die den kleinen Vakuolen aus Höheren Pflanzen ähnlich sind. Die Ca2+-transportierende Funktion von PCA1 wurde nach Entfernung der autoinhibitorischen Domäne durch Komplementation von Hefemutanten bestätigt. Dabei konnte auch der Einfluss von PCA1 bei der Kompensation von Salzstress in Hefe gezeigt werden. Für die funktionelle Analyse von PCA1 in Physcomitrella wurde dessen Genexpression untersucht. Eine Beeinflussung der Transkriptmenge durch Zugabe von Cytokinin oder Zucker konnte dabei nicht nachgewiesen werden. Mittels gezielter Disruption des pca1-Gens wurden drei Knockout-Pflanzen hergestellt und verschiedenen Versuchsbedingungen ausgesetzt, um die resultierende Veränderung des Phänotyps beschreiben zu können. Dabei zeigte sich, dass NaCl-Stress, Kalziummangel oder die Zugabe von Schwermetallsalzen keine visuelle Veränderung des Phänotyps der K.O.-Pflanzen im Vergleich zum Wildtyp erbrachte. Die Beobachtung von sich regenerierenden Protoplasten über einen längeren Zeitraum ergab jedoch, dass bei den K.O.-Pflanzen die Zahl der gebildeten Gametophoren vermindert war. Dies führte zum Schluss, dass die P2B-Kalzium-ATPase PCA1 eine wichtige Rolle bei der Homöostase der cytoplasmatischen Kalziumkonzentration spielt und indirekt an der Entwicklung von Gametophoren in Physcomitrella patens mitwirkt.

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