Affordable Access

Genomikai és fenomikai megközelítések kombinálása az árpa szárazságtűrésének jellemzésében

Authors
Publication Date

Abstract

Jelenleg világszerte és hazánkban is a szárazságstressz az egyik legjelentősebb termés korlátozó tényező a gabonafélék, így az árpa esetében is. Következésképpen a legfőbb nemesítési célok közé tartozik új, fokozottabb szárazságtoleranciával rendelkező fajták előállítása. A nemesítés sikeressége nagymértékben függ attól, hogy sikerül-e megértenünk e komplex és kvantitatív jellegű tulajdonság kialakításában részt vevő genetikai faktorokat. A komplex tulajdonságok, mint például a szárazsághoz történő alkalmazkodás fejlesztését elősegítheti a genomikai és fenomikai megközelítések kombinációja. A meglévő természetes genetikai variabilitás meghatározása pedig értékes információval szolgálhat a szárazságtűrésben résztvevő gének funkcióját illetően. A genotípus-fenotípus asszociációk együttes vizsgálata lehetővé teheti a vizsgált génjelöltek szárazságtoleranciában betöltött funkciójának megerősítését. Az árpa szárazságtűrésben potenciálisan szerepet játszó génjelöltek genomikai adatait a polimorfizmusok hatékony feltárására alkalmas EcoTILLING technológia használata útján nyertük. A fenomikai adatsorokat üvegházi körülmények között, Komplex Stressz Diagnosztikai Rendszer alkalmazásával állítottuk elő. Az EcoTILLING módszer egy nagy kapacitású, viszonylag alacsony költséggel kivitelezhető eljárás, mely lehetővé teszi a természetes populációkban megtalálható polimorfizmusok hatékony detektálását. A módszer a TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) technológia egyik változata, amely bizonyos PCR lépéseken alapszik, úgymint heteroduplex kézés, valamint a kialakult mismatch pozíciók nukleáz enzimekkel történő emésztése. A technológia alkalmazása útján egyaránt lehetővé válik a polimorfizmusok feltárása, illetve a haplotípusok elkülönítése az azonosított egyedi haplotípusok szekvenálása útján. Kutatásaink céljai között szerepelt az árpa szárazságtűrésének hátterében álló genetikai faktorok vizsgálata a fenomikai és genomikai megközelítések egyesítésének útján. Az EcoTILLING reakció magában foglalta a vizsgált génszakasz fluoreszcens nukleotidok jelenlétében végzett PCR-amplifikációját. A kapott amplikonokat a heteroduplex képzés után az egyszálú DNS-re specifikus aktivitással rendelkező Cel1-es endonukleázzal emésztettük a „mismatch” pozíciókban, majd ABI 377-es szekvenáló készüléken különítettük el a fragmentumokat molekulaméretük szerint. Végül az azonosított haplotípusokat forward és reverz irányból is megszekvenáltuk. Vizsgálatainkhoz a világ számos pontjáról gyűjtött 96 genotípust /termesztett fajtákat, ökotípusokat és vad változatokat/ is tartalmazó, szárazságtűrés szempontjából variábilis árpa kollekciót állítottunk össze. A génjelöltek kiválasztása során a szárazságtűréssel foglalkozó szakirodalmi adatokra (gén expressziós, illetve QTL térképezési vizsgálatok, transzgenikus kutatások) támaszkodtunk. Elsődleges célunk volt az árpa szárazság tűrésében potenciálisan szerepet játszó génjelöltek természetes genetikai variabilitásának feltárása az EcoTILLING technológia, mint a polimorfizmusok azonosítására alkalmas eszköz alkalmazása útján. További céljaink között szerepelt könnyen detektálható genetikai markerek (potenciálisan „génen belüli markerek”) kifejlesztése az átfedő haplotípus szekvenciák birtokában, amelyek lehetővé teszik a főbb, elsősorban aminosav szinten különbséget mutató haplotípusok elkülönítését. Az alkalmazott technológia segítségével mintegy 1,5 millió bázispárnyi szekvencia vizsgálata nyomán 94 egyedi allélvariánst különítettünk el a 9 génre tervezett 18 amplikon elemzése útján. Egy bázispárnyi eltérést (SNP) 185, inszerció/deléció-t (InDel) pedig 46 esetben azonosítottunk, a polimorfizmusok átlagos gyakorisága 1 SNP/92 bp illetve 1 InDel/372 bp volt. Az amplikonok vizsgálata során az azonosított haplotípusok száma 2 és 9 közé esett. Összesen 4 gén – Hordeum vulgare L. AR-h gene for aldose reductase (HvARH1), Hordeum vulgare L. HVA1 gene (HvA1), Hordeum vulgare L. HvSRG6 gene for stress responsive gene protein 6 (HvSRG6), Hordeum vulgare L. AP2 transcriptional activator gene (HvDRF1) - esetében olyan informatív polimorfizmusokat konvertáltunk át genetikai markerekké, melyek által elkülöníthetők a valószínűsíthetően funkcionális allélvariánsok. Továbbá ezek a könnyen detektálható genetikai markerek hasznosíthatók kapcsoltsági térképezések során illetve a markerekre alapozott szelekcióban. Kutatásaink további fontos eleme volt egy árpa genotípus törzskollekció szárazságra adott válaszreakcióinak jellemzése a morfológiai, fiziológiai és agronómiai paraméterek monitorozása útján kontroll és stresszelt körülmények között Komplex Stressz Diagnosztikai Rendszer használatával. Célul tűztük ki továbbá a tesztelt genotípusok fenotipikus stressz paraméterek és a szárazságtűrésben szerepet játszó génjelöltek azonosított haplotípusainak összetétele közötti kapcsolatok feltárását. Célunk volt ezen túlmenően egy, az árpa szárazságtűrásének jellemzésére használható alapvető metodika kialakítása a fenotípusos és haplotípusos eredmények együttes kiértékelése útján. A szárazságtolerancia mértékének és további fontos agronómiai tulajdonságok Komplex Stressz Diagnosztikai Rendszerben történő tesztelése érdekében összeállítottunk egy 23 genotípust tartalmazó árpa törzskollekciót. A morfológiai és fiziológiai tulajdonságok monitorozását kontroll (60 %-os vízellátottság a teljes tenyészidő alatt) és stressz (20 %) körülmények között különböző képalkotó eljárások alkalmazásával végeztük. A morfológiai, fiziológiai tulajdonságok, illetve a szárazságtűréssel összefüggésbe hozható agronómiai paraméterek vizsgálatát többek között digitalis fényképezés, illetve hőkamerás levélhőmérséklet meghatározás alkalmazásával egy fél-automata fenotipizálásra alkalmas eszköz, a Komplex Stressz Diagnosztikai Rendszer használatával végeztük el. Vizsgálataink során jelentős mértékű korrelációt találtunk a vizsgált genotípusok termésmennyisége illetve további fontos agronómiai paraméterei között, mint például a harvest index, a vízhasznosító képesség és az ezerszemsúly. Ezen eredmények a Komplex Stressz Diagnosztikai Rendszer használatából fakadó előnyökre hívhatják fel a figyelmet. A hőkamerás mérések alkalmával a szárazság stressznek kitett növények esetében magasabb levélhőmérsékleti értékeket detektáltunk. A kiválasztott genotípusok esetében a mért levélhőmérséklet és a pixel alapú zöldfelület között kapcsolatot lehetett kimutatni. A meghatározott pixel alapú zöldfelület alapján a genotípusokat stressz reakciójuk szerint toleráns és szenzitív kategóriákba soroltuk az csökkenés 45 %-os értékét elkülönítő szintként választva. Az analízis során a toleráns és a szenzitív kategóriákba tartozó genotípusok haplotípus összetételében jelentős különbségeket találtunk a HvA1 gén esetében. A genotípusokat termésstabilitásuk szerinti rangsor alapján szintén toleráns és a szenzitív kategóriákba soroltuk a terméskiesés 55 %-os értékét küszöbszintként véve alapul. A toleráns, illetve szenzitív genotípusok haplotípus összetételét összehasonlítva a HvDRF1 és a HvNHX1 gén esetében lényeges eltéréseket találtunk. A haplotípusok és a fenotípusos paraméterek t-teszten alapuló asszociációs vizsgálata során az árpa patogén gombák által indukált fehérjéjét kódoló gén (HvPPRPX) B-haplotípusa valamint a harvest index, az ezerszemsúly, a vízhasznosítási hatékonyság és a szemtermés között pozitív összefüggést tártunk fel. A kísérleteink eredményeként rendelkezésre álló fenotípus és haplotípus információkat tartalmazó adatsorok fontos kiindulási pontjai lehetnek a szárazságtűrésben fontos szereppel rendelkező génvariánsok QTL illetve asszociációs vizsgálatokkal történő azonosítása során.

There are no comments yet on this publication. Be the first to share your thoughts.