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Configuration, optimization and evaluation of a novel instrumental platform for automated SPE-LC-MS/MS analysis of drugs in whole blood

Authors
Publisher
Ludwig-Maximilians-Universität München
Publication Date
Keywords
  • Medizinische Fakultät

Abstract

Die Doktorarbeit beschreibt die Konfiguration, Optimierung und Evaluierung einer neuartigen instrumentellen Plattform für die vollständig automatisierte SPE-LC-MS/MS Analyse von kleinen Molekülen, wie beispielsweise Arzneistoffe, im Vollblut. Das Immunsuppressivum Cyclosporin A wurde als Modellanalyt gewählt, da dieser Arzneistoff vorwiegend an Erythrozyten gebunden ist. Zunächst wird antikoaguliertes Blut durch eine Hitze- oder Kälteschock Behandlung in sogenanntes Zell-desintegriertes Blut (Cell-Disintegrated Blood, CDB) überführt. CDB stellt eine homogene Blutprobe dar und besteht aus subzellulären Partikel, die beim Stehen nicht sedimentieren und keine Kapillaren, Siebe und HPLC- Packungsmaterialien verstopfen. Für die in-line Behandlung von antikoagulierten Vollblut, d.h. für die Herstellung von CDB, wurde ein Gerät zum Mischen der Probe, zwei spezielle Bauteile für die Handhabung von Flüssigkeiten und zwei selbst-gebaute Module für die Probenprozessierung in einen XYZ-Probengeber eingebaut. Das Modul für die Hitze-Schock Behandlung besteht aus einer Edelstahlkapillare, die mit einer Heizmanschette ummantelt ist. Unter optimalen Bedingungen für die Probenahme und in-line Prozessierung von 20 µL Vollblut werden 13 Sekunden und 75 °C benötigt um CDB herzustellen. Letzteres wird vor einer weiteren Behandlung in einer Rückhalteschleife gelagert. Für die Tieftemperatur Behandlung einer Blutprobe wurde eine weitlumige Edelstahlnadel zur Prozessierung in eines der Bauteile für die Handhabung von Flüssigkeiten eingebaut. Der Probengeber wurde so programmiert, dass die Nadel, welche die Blutprobe (40 µL) enthält, in ein Steigrohr, welches sich in einem mit flüssigem Stickstoff gefüllten Isolierbehälter befindet, eingeführt wird. Hierdurch wird die Nadel mit flüssigem Stickstoff kontaktiert und die Blutprobe schockgefroren. Als optimale Bedingungen wurden 10 Sekunden für das Schockgefrieren bei -196 °C und 60 Sekunden für das Auftauen bei Raumtemperatur gefunden. Eine CDB Probe, die entweder durch Hitze- oder Kälteschock-Behandlung gewonnen wurde, wird weiter prozessiert, indem sie über ein Schaltventil durch einen in-line Filter gepumpt wird, um Zellkerne und „Zellbruchstücke“ zurückzuhalten. Es stellte sich heraus, dass ein Tiefenfilter, der mit sphärischem hydrophilem Kieselgel gepackt ist, optimal ist. Dieser Filter ermöglicht mindestens 200 Analysen-Zyklen bevor er ausgetauscht werden muss. In einem weiteren Schritt wird die CDB Probe on-line über ein weiteres Schaltventil mit einer hohen Flussrate durch eine SPE Säule (50 x 0.5 mm ID) gepumpt. Aufgrund des speziellen Packungsmaterials und dem sehr kleinen Innendurchmesser wird eine hohe lineare Flussgeschwindigkeit erreicht und eine turbulente Strömung erzeugt. Hierdurch werden hochmolekulare Matrixkomponenten wie beispielsweise Proteine im Totvolumen in den Abfall eluiert. Niedermolekulare Zielanalyte wie Cyclosporin A und der interne Standard Cyclosporin D werden über Umkehrphasen- Verteilungschromatographie (RPC) reteniert und extrahiert. Nach der Fraktionierung von CDB auf der SPE Säule, wird der Analyt und der interne Standard auf eine in Serie geschaltete analytische Säule überführt und von restlichen Matrixbestandteilen über RPC abgetrennt. Zum Schluss wird der Analyt in einem Tandem-Massenspektrometer über eine Elektrospray Ionisation (ESI) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) detektiert. Die optimierte Methode weist eine Gesamtanalysezeit von weniger als 11 Minuten auf. Das Analysenverfahren und die instrumentelle Plattform wurden für Hitzeschock behandelte Blutproben hinsichtlich Linearität, Messbereich (10 – 1000 ng/mL), unterer Bestimmungsgrenze (10 ng/mL), Richtigkeit und Präzision innerhalb eines Tages und von Tag zu Tag, sowie Matrix-unabhängiger und Matrix-abhängiger Wiederfindung (um 100 %) validiert. Es konnte gezeigt werden, dass die über Elektrospray induzierte Ionisation um ca. 25 % unterdrückt wird. Diese Matrixeffekte können jedoch durch Zugabe des internen Standards Cyclosporin D vollständig kompensiert werden. Ein Vergleich mit einer teilautomatisierten SPE-LC-MS/MS Routinemethode, die im Institut etabliert ist, ergab eine sehr gute Übereinstimmung. Dies konnte anhand von Passing und Bablok Plots aufgezeigt werden. Die Robustheit der vollständig automatisierten SPE-LC-MS/MS Analysenplattform wurde während 500 aufeinander folgenden Analysezyklen mit Hitzeschock behandelten Blutproben überprüft. Die relative Standardabweichung für das MS-signal betrug 15.6 % für Cyclosporin A und 15.2 % für Cyclosporin D. Der Rückdruck des gesamten Systems stieg nur um 52 bar an. Diese Ergebnisse zeigen, dass – trotz der instrumentellen und chromatographischen Komplexität – die beschriebene Analysenplattform die Anforderungen, die in der klinisch-chemischen Routineanalytik gestellt werden, erfüllt.

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