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New synthetic strategies to tethered bilayer lipid membranes

Authors
Publisher
Johannes Gutenberg-Universität
Publication Date

Abstract

Inhaltszusammenfassung in der Originalsprache des Dokuments (englisch) Tethered bilayer lipid membranes provide an efficient, stable and versatile platform for the investigation of integrated membrane proteins. However, the incorporation of large proteins, as well as of proteins with a large submembrane part is still a very critical issue and therefore, further optimisation of the system is necessary. The central element of a tBLM is a lipid bilayer. Its proximal leaflet is, at least to some extend, covalently attached to a solid support via a spacer group. The anchor lipid consists of three distinct parts, a lipid headgroup, a spacer group and an anchor. All parts together influence the final bilayer properties. In the frame of this work, the synthesis of new thiolipids for tBLMs on gold has been investigated. The aim was to obtain molecules with longer spacers in order to increase the submembrane space. The systems obtained have been characterized using SPR and EIS. The results obtained during this study are multiple. First, the synthesis of a previously synthesized architecture was successfully scaled up in an industrial lab using a new synthetic approach. The synthesis of large amounts is now feasible. Then, the synthesis of the new thiolipids was carried out taking into account the following requirements: the increase of the submembrane space by having longer ethyleneglycol spacers, the attachment of the molecules to a gold substrate via a thiol bond, and the tunability of the lateral mobility by changing the lipid headgroup. Three different synthetic strategies have been investigated. The polymeric approach did not prove to be successful, merely because of the broad molecular weight distribution. The synthesis of heterofunctionally protected oligoethyleneglycols allowed to obtain ethyleneglycol moieties with 6 and 8 units, but the tedious purification steps gave very low yields. Finally, the block by block synthesis using ethyleneglycol precursors proved to be an efficient and fast method to synthesize the target molecules. Indeed, these were obtained with very high yields, and the separation was very efficient. A whole family of new compounds was obtained, having 6, 8 and 14 ethyleneglycol units and with mono- or diphytanyl lipid headgroups. This new pathway is a very promising synthetic strategy that can be used further in the development of new compounds of the tether system. The formation of bilayers was investigated for the different thiolipids mainly by using EIS. The electrical properties of a bilayer define the quality of the membrane and allow the study of the functionality of proteins embedded in such a system. Despite multiple trials to improve the system using self assembly, Langmuir Blodgett transfer, and detergent mixed vesicles, the new polymer thiolipids did not show as high electrical properties as tBLMs reported in the literature. Nevertheless, it was possible to show that a bilayer could be obtained for the different spacer lengths. These bilayers could be formed using self assembly for the first monolayer, and two different methods for bilayer formation, namely vesicle fusion and solvent exchange. We could furthermore show functional incorporation of the ion carrier valinomycin: the selective transport of K+ ions could be demonstrated. For DPHL, it was even possible to show the functional incorporation of the ion channel gramicidin. The influence of the spacer length is translated into an increase of the spacer capacitance, which could correspond to an increase in the capacity of charge accumulation in the submembrane space. The different systems need to be further optimised to improve the electrical properties of the bilayer. Moreover, the incorporation of larger proteins, and proteins bearing submembrane parts needs to be investigated. -------------------------------------------------------------------------------- Inhaltszusammenfassung in einer weiteren Sprache (deutsch) Festkörperunterstützte, verankerte Lipid Doppelschichten (tBLM) bieten eine effiziente, stabile und vielseitige Basis für die Untersuchung von inkorporierten Membranproteinen. Der Einbau von grossen Proteinen, sowie Proteinen mit submembranen Domänen ist allerdings immer noch problematisch, und deswegen ist eine weitere Optimierung des Systems notwendig. Das zentrale Element einer tBLM ist eine Lipid Doppelschicht. Die untere Monolage ist mit Hilfe einer Abstandshaltergruppe kovalent an eine Oberfläche gebunden. Das Ankerlipid besteht aus drei Teilen, einem Lipidkopf, einem Abstandshalter und einer Ankergruppe. Alle Teile beeinflussen die Eigenschaften der Doppelschicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Synthese von neuen Thiolipiden für tBLMs auf einer Goldoberfläche mit längeren Abstandshaltern zur Vergrösserung des Reservoirs unter der Membran untersucht. Die erhaltenen Systeme wurden mit SPR und EIS charakterisiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind vielfältig. Für die Synthese eines bekannten Thiolipids wurde ein Syntheseweg für Industriemassstäbe entwickelt und optimiert. Die Synthese grösserer Mengen ist jetzt möglich. Neue Thiolipide wurde unter Berücksichtigung folgender Anforderungen geplant und synthetisiert: die Vergrösserung des Abstands zwischen Membran und Substrat mittels längerer Ethylenglykol-Abstandshalter; die Verankerung der Moleküle auf einer Oberfläche mit Hilfe von Thiolbindungen; die Veränderung und Anpassung der lateralen Beweglichkeit der Membran durch verschiedene Lipidköpfe. Drei verschiedene Strategien wurden untersucht. Der Ansatz über Polymerisation war nicht erfolgreich, hauptsächlich wegen der hohen Polydispersität der erhaltenen Moleküle. Die Synthese von heterofunktionalisierten Oligoethylenglykolen ermöglichte die Gewinnung von Ethylenglykolketten mit 6 und 8 Einheiten. Die aufwendigen Reinigungs- und Trennungsschritte erlaubten nur eine sehr niedrige Ausbeute. Die „bloc by bloc“ Synthese mit geschützten Ethylenglykolgruppen war eine erfolgreiche und schnelle Methode zur Synthese der Zielverbindungen. Die Trennung war sehr effizient und die Verbindungen wurden mit sehr hohen Ausbeuten erhalten. Eine ganze Serie von neuen Thiolipiden, mit 6, 8 und 14 Ethylenglykol-Einheiten mit mono- oder diphytanyl Kopfgruppen konnte erhalten werden. Dieser neue Syntheseweg ist eine vielversprechende Strategie, die für die Entwicklung neuer tBLMs Bestandteile. Die verschiedenen Synthetisierten Thiolipide wurden als Basis für Lipid Doppelschichten verwendet. Die Charakterisierung der Systeme erfolgte vor allem per Impedanzspektroskopie. Die elektrischen Eigenschaften einer Doppelschicht sind ein wichtiges Kriterium für die Qualität der Membran und erlauben die Untersuchung der Funktionalität von eingebauten Proteinen. Obwohl viele Versuche zur Verbesserung des Systems z.B. mittels self assembly, LB transfer und Vesikeln gemischt mit Detergenz unternommen wurden, zeigen die Polymerthiolipide keine so guten elektrischen Eigenschaften wie in der Literatur beschriebene tBLMs. Es war hingegen möglich zu zeigen, dass sich aus allen hier diskutierten Verbindungen Membranen herstellen lassen. Diese Doppelschichten wurden durch Selbstorganisation des ersten Monolayers gebildet, und zwei verschiedene Methoden wurden für die Doppelschichtbildung benutzt, Vesikelfusion und schneller Lösungsmittelwechsel. In den meisten Fällen war der Einbau des Ionen-Transporters Valinomycin erfolgreich. Der selektive Transport von K+ Ionen wurde an diesem Beispiel gezeigt. Für DPHL konnte der Ionenkanal Gramicidin funktionell eingebaut werden. Die Auswirkung der Abstandslänge bewirkt eine Zunahme der Abstandskapazität, die zu einer Erhöhung der Ladungsakkumulation im submembranen Teil der Membranarchitektur führt. Die verschiedenen Systeme müssen weiter optimiert werden, um die elektrischen Eigenschaften der Doppelschicht zu verbessern. Der nächste Schritt ist der Einbau von grösseren Proteinen mit submembranen Domänen.

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