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Identifikation intrazellulärer Interaktionspartner der Rezeptortyrosinkinasen UFO und MET im Two-Hybrid-System

Authors
Publisher
Universität Ulm. Medizinische Fakultät
Publication Date
Keywords
  • Apoptosis
  • Hepatozyten-Wachstumsfaktor
  • Onkogen
  • Proteomanalyse
  • Rezeptor-Tyrosinkinasen
  • Signaltransduktion
  • Transformation Von Hefezellen
  • Yeast-Two-Hybrid-System
  • Two-Hybrid-System Techniques
  • Tyrosinkinaserezeptor
  • Ufo
  • Screening Von Cdna Fusionsbibliotheken
  • Interaction Trap

Abstract

Das Two-Hybrid-System ist eine relativ neue molekularbiologische Methode, die es erlaubt, Wechselwirkungen von Proteinen in vivo zu studieren und auf diese Weise bekannte und womöglich neue Substrate eines Zielproteins zu identifizieren. Hauptziel der hier vorliegenden Arbeit war es, zu prüfen, ob sich dasTwo-Hybrid-System dazu eignen würde, intrazelluläre Interaktionspartner der beiden Rezeptortyrosinkinasen UFO (= unknown function of an oncogene) bzw. MET (= HGF = hepatocyte growth factor) näher zu charakterisieren und beim Durchmustern von Fusionsbibliotheken neue Substrate für diese beiden Onkogene identifizieren. Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Klonierung der intrazellulären Anteile der beiden Rezeptoren in Hefeexpressionsvektoren der DNA bindenden Domäne pGBT9 (= GAL4 DNA binding domain with target protein) bzw. pAS2 (= GAL4 DNA binding domain with advanced selection) sowie den Nachweis erfolgreicher Proteinexpression und (Auto-) Phosphorylierung aller Konstrukte in vivo. Um die relativ schwache Tyrosinkinaseaktivität von UFO und die damit eingeschränkte Fähigkeit zur Bindung von Substraten zu erhöhen, verwendeten wir das Fusionskonstrukt TPR-UFO (= translocated promoter region). Es zeigte sich, dass das Rezeptorkonstrukt TPR-UFO stärker autophosphoryliert wurde als UFO. Außerdem wurden unsere Konstrukte im Vektor pGBT9 quantitativ ähnlich stark, aber deutlich stabiler exprimiert als im Vektor pAS2. Entsprechende Publikationen während dieses Zeitraumes bestätigten dieses Ergebnis. Wir verwendeten daher im weiteren Verlauf ausschließlich pGBT9-Konstrukte. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass sich die zu erwartende Transformationseffizienz durch Kultur der Hefezellen in sogenannten Schikanekolben unter maximalem Selektionsdruck, durch erhöhten Adenin-Gehalt der Kulturmedien, durch Verwendung hochmolekularer Carrier-DNA und von DMSO ( = Dimethylsulfoxid ) bei der Transformation von Hefen, sowie durch die Titration von cDNA-Bibliotheken deutlich steigern lässt. Die Transformationseffizienz kann als entscheidendes Kriterium für die erfolgreiche Durchführung des Two-Hybrid-Systems angesehen werden. Durch Kotransformationen konnten wir drei bereits bekannte Interaktionspartner der Rezeptortyrosinkinase UFO, nämlich Phospholipase Cg, P85a (= eine Untereinheit der Phosphatidylinositol 3-Kinase) und GRB2 (= growth factor receptor binding protein 2) im Two-Hybrid-System bestätigen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Durchmustern von Fusionsbibliotheken nach neuen Interaktionspartnern für die beiden Rezeptortyrosinkinasen UFO und MET. Für den in unserer Arbeitsgruppe entdeckten und klonierten Tyrosinkinaserezeptor UFO konnten in verschiedenen cDNA-Bibliotheken (rat embryo, human fetal liver und thymus) zwar mehrfach Interaktionen mit GRB2 bestätigt, aber keine neuen Substrate isoliert werden. Beim Screening der Fusionsbibliothek rat embryo mit unserem zweiten Zielprotein TPR-MET konnten wir neben dem bereits erwarteten GRB2 auch die Proteine SNX2 (= sorting nexin 2 ), ZIP Kinase (= zeta interacting protein ), Tid56 (= tumorous imaginal disc protein 56 ), BICD (= bicaudal D ) und LB1 (= human lamin B1 ), sowie darüber hinaus die kodierenden Teilsequenzen von zwei bisher unbekannten, noch nicht näher charakterisierten Genen, als neue Interaktionspartner ermitteln. In nachfolgenden Untersuchungen wird derzeit der Versuch unternommen, mögliche Wechselwirkungen zwischen SNX2, Tid56 bzw. BICD und den beiden unbekannten Proteinen mit der zytoplasmatischen Domäne des Tyrosinkinaserezeptors MET zu verifizieren, um darüber neue Einsichten in die MET - vermittelte Signalkaskade zu gewinnen.

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