Affordable Access

Ultrastructural immunocytochemistry of a Leydig cell enzime and sperm tail protein using antigen retrieval by microwave irradiation

Authors
Publisher
Treballs de la Societat Catalana de Biologia
Publication Date

Abstract

Presentem aquí un protocol simple i ràpid per a la localització de diversos antígens en mostres biològiques incloses en resines acríliques per electromicroscòpia i immunoprecipitació amb or. S'han utilitzat cèll. ules de Leydig de rates adultes separades per gradients de densitat i espermatozoides humans per estudiar la localització subcell. ular d'antígens específics i analitzar la influència de l'exposició a la irradiació per microones sobre la immunoreactivitat valorada per marcatge d'or immunoprecipitat sobre material fixat per formaldehid i inclòs en LR White. Es varen utilitzar seccions ultrafines muntades sobre suports de níquel i immerses en tampó citrat, exposant-les a la irradiació per microones (a màxima potència: 800 W) durant breus períodes de temps. La microscòpia immunoelectrònica es va fer utilitzant anticossos primaris contra l'enzim esteroidogènic (3-beta-hidroxiesteroid-deshidrogenasa, 3-beta-HSD) del reticle endoplasmàtic llis i una proteïna del citosquelet de l'embolcall fibrós de l'espermatozoide (AKAP4). L'anticòs secundari utilitzat fou una immunoglobulina anticonill conjugada amb or (partícules de 15 nm). Les seccions control es varen incubar en sèrum no immune. Les seccions varen ser breument exposades a tetraòxid d'osmi i a acetat d'uranil o foren analitzades, senzillament, sense cap tipus de tinció. El marcatge es va expressar per densitat de partícules d'or per µm2. El soroll de fons fou negligible. La localització de la 3-beta-HSD fou específica en el reticle endoplasmàtic llis de les cèll. ules de Leydig, mentre que els mitocondris i les gotes lipídiques foren negatives. La proteïna AKAP4, principal component de l'embolcall fibrós de la cua de l'espermatozoide i clàssicament localitzada en les fibres d'aquest embolcall fibrós, i en altres components de la cua de l'espermatozoide, varen ser negatius. Després de l'exposició de les seccions a les microones, la densitat de partícules d'or en el reticle endoplasmàtic llis de les cèll. ules de Leydig i en l'embolcall fibrós dels espermatozoides havia augmentat tres vegades en relació amb els mateixos teixits no exposats a les microones, sense comprometre la localització específica de la immunotinció. Aquest mètode permet un augment significatiu de la sensibilitat i de la densitat del marcatge sense modificar les concentracions d'anticòs, l'especificitat o la tinció no específica o de soroll de fons.

There are no comments yet on this publication. Be the first to share your thoughts.