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Proteome analysis of laser microdissected glomeruli from formalin-fixed paraffin-embedded kidneys of autopsies of diabetic patients:Nephronectin is associated with the development of diabetic glomerulosclerosis

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氏名(生年月日)          (         ) 氏 名 仲谷 慎也 学 位 の 種 類 博士( 医学 ) 学 位 記 番 号 第 5768 号 学位授与年月日 平成 24年 3月 23日 学位授与の要件 学位規則第 4条第 1項該当者 学 位 論 文 名 Proteome analysis of laser microdissected glomeruli from formalin-fixed paraffin-embedded kidneys of autopsies of diabetic patients: Nephronectin is associated with the development of diabetic glomerulosclerosis (糖尿病患者剖検例のホルマリン固定パラフィン包埋腎組織よりレーザーマ イクロダイセクションにて単離した糸球体のプロテオミクスーネフロネク チンは糖尿病性糸球体硬化症に関連する-) 論文審査委員 主 査 鰐渕 英機 教授 副 査 稲葉 雅章 教授 副 査 三浦 克之 教授 論 文 内 容 の 要 旨 【目的】糖尿病性腎症では腎生検がほとんどなされず、糸球体を用いたプロテオミクスは困難であり、 未だ報告がない。本研究では、剖検症例のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腎組織を用いてプ ロテオミクスを行い、糖尿病性腎症糸球体において発現の変動している蛋白質に関して検討した。 【方法】糖尿病性腎症患者剖検例 10例、および非糖尿病患者剖検例 10 例の FFPE腎組織よりレーザ ーマイクロダイセクション法にて糸球体を単離、Liquid Tissues 試薬・iTRAQ ラベリング法を用い 試料調節し、QSTAR Elite LC-MS/MSにてプロテオミクスを施行した。さらに 93例の糖尿病患者剖検 例(腎症有り 45例、腎症無し 48 例)に対し免疫染色を行い、蛋白質の発現と糸球体硬化度の関連に つき検討した。 【結果】 両群間において100個の蛋白質の発現変動を認めた。Ingenuity pathway analysisにて蛋白 質の機能・性質を解析した結果、31個の腎・泌尿器関連蛋白質を同定した。そのうち、細胞外基質の 増生に関わるネフロネクチンが糖尿病性腎症糸球体に高発現していた(1.25倍、p=0.0006)。ネフロ ネクチンの免疫染色において、糖尿病性腎症有り群の糸球体は糖尿病性腎症無し群の糸球体に比べて 有意に高率に陽性染色された(腎症有り:32.1%±31.5% vs. 腎症無し:4.14%±5.65%, p<0.0001)。 またネフロネクチン陽性糸球体の割合と糸球体硬化度との間には正の相関関係が見られた( p<0.0001, n=93)。 【結論】FFPE 腎組織の単離糸球体のプロテオミクスにおいて、ネフロネクチンは糖尿病性腎症で有 意に高発現していた。免疫染色でネフロネクチン陽性糸球体の割合と糸球体硬化度には有意な正相関 を認めた。ネフロネクチンは糖尿病性腎症に関わる新規蛋白質であることが示唆された。 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 糖尿病性腎症は本邦の新規血液透析導入疾患の第一位である。臨床において微量アルブミン尿がバ イオマーカーとして用いられているが、微量アルブミン尿は必ずしも糸球体変化を反映せず、バイオ マーカーとしての有用性には限界がある。微量アルブミン尿に代わり糸球体変化を反映する新規バイ オマーカーの同定や、糖尿病性腎症の進行に関わる因子を網羅的に解析するために、糖尿病患者の糸 球体を用いたプロテオミクスが望まれている。 本研究では、糸球体組織を反映するバイオマーカー候補蛋白質の同定や、糖尿病性腎症の病態の解 明のため、糖尿病性腎症患者剖検症例のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腎組織を用いたプロテ オミクスを行った。対象は糖尿病性腎症患者剖検例 10例、および非糖尿病患者剖検例 10例であり、 レーザーマイクロダイセクション法にて糸球体を単離、Liquid Tissues 試薬・iTRAQ ラベリング法を 用い、蛋白質の発現を定量比較した。 両群間において発現の変動していた 100個の蛋白質を Ingenuity Pathway Analysis にて詳細に検 討し、31 個の腎・泌尿器関連蛋白質が同定された。それらの蛋白質のうち、細胞外基質の増加に関 わるネフロネクチンが糖尿病性腎症患者の糸球体に高発現して

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