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Mycobacterial adenylyl cyclases Rv1625c and Rv0386: orthodox vs. unorthodox catalysis

Authors
Publisher
Universität Tübingen
Publication Date
Keywords
  • Adenylatcyclase
  • Mycobacterium
  • Tuberculosis
  • Adenylyl
  • Cyclase
  • Mycobacterium
  • Chemistry And Allied Sciences

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Klasse III ACn aus Mycobacterium tuberculosis mit unterschiedlicher strukturellen und katalytischen Eigenschaften untersucht: die Mammalia-ähnliche Rv1625c und die an einen Transkriptionsfaktor gebundene Rv0386. Als ergänzende Studien zu bereits publizierten Daten (Guo et al., 2001), wurden zur Überprüfung der wesentlichen Rolle der sechs kanonischen Aminosäuren, die bei Mammalia-ACn in der Katalyse beteiligt sind und die in Rv1625c konserviert und auch katalytisch relevant sind, zusätzliche Punktmutationen durchgeführt und getestet. Die Rv1625c Mutanten N372A, N372T und D300S, die einzeln inaktiv sind, wurden für Rekonstitutionsversuchen benutzt wobei die Bildung katalytisch aktiver Homodimere in Rv1625c nachgewiesen wurde. Punktmutationen in Rv1625c, die Forskolin-bindende Aminosäuren in Säugercyclasen betreffen, erfahren dennoch keine Stimulierbarkeit durch das Diterpen. Die Ähnlichkeiten in Struktur und katalytischem Mechanismus zwischen ACn und GCn wurden hier bestätigt, da Chimären zwischen Mycobacterium Rv1625c und einer Guanylatcyclase aus Paramecium aktive katalytische Zentren gebildet haben. Die Vielseitigkeit der Klasse-III Cyclase Homologie Domänen hinsichtlich ihres modularen Aufbaus und ihres katalytischen Mechanismus wurde hier durch die biochemische Charakterisierung von Rv0386 nachgewiesen. Dieses Enzym zeigte einen Mechanismus zur Erkennung des Substrates, der sich von dem der Mammalia-ACn deutlich unterscheidet. Dieser ermöglicht die Erkennung sowohl von ATP als auch GTP als Substrat und ist eine Eigenschaft, die bis jetzt in keiner anderen AC Isoform beobachtet wurde. Mutationen der AC Domäne beweisen die essentielle Rolle, die Glutamin und Asparagine statt dem kanonischen Lysin und Aspartat bei der Erkennung der Substrate ATP und GTP in Rv0386 spielen. Der Erhalt der ersten diffraktionsfähigen Kristalle der AC Domäne innerhalb dieser Arbeit ist ein erster Schritt zur Erkenntnis der Besonderheiten ihrer katalytischen Funktion. Die Suche nach Sequenz Ähnlichkeiten zeigte, dass Rv0386 zusätzlich zu der AC Domäne aus ATPase-, HTH DNA-bindungs- und Transkriptionsfaktor-Domänen besteht. Noch zu beantworten bleibt die Frage, wie die regulatorische Verbindung zwischen der AC Domäne und dem Transkriptionsregulator AC Aktivität und weitere unbekannte Regulationsmechanismen beeinflusst.

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