Stabilisierte mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt für die Gentherapie

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine mRNA, die durch Sequenzmodifikationen im translatierten Bereich stabilisiert und für die Translation optimiert ist bzw. die entsprechende modifizierte mRNA. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung eignet sich als Therapeutikum zur Gentherapie insbesondere zur Geweberegeneration.Die Gentherapie und die genetische Vakzinierung sind molekularmedizinische Verfahren, deren Anwendung in der Therapie und Prävention von Erkrankungen erhebliche Auswirkungen auf die medizinische Praxis haben wird. Beide Verfahren beruhen auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen bzw. in Gewebe des Patienten sowie auf der anschließenden Verarbeitung der durch die eingebrachten Nukleinsäuren codierten Information, d.h. der Expression der erwünschten Polypeptide.Die übliche Vorgehensweise bisheriger Verfahren der Gentherapie und der genetischen Vakzinierung ist die Verwendung von DNA, um die benötigte genetische Information in die Zelle einzuschleusen. In diesem Zusammenhang sind verschiedene Verfahren zur Einbringung von DNA in Zellen, wie bspw. Calciumphosphat-Transfektion, Polypren-Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Mikroinjektion und Lipofektion, entwickelt worden, wobei sich insbesondere die Lipofektion als geeignetes Verfahren herausgestellt hat.Ein weiteres Verfahren, das insbesondere bei genetischen Vakzinierungsverfahren vorgeschlagen wurde, ist die Verwendung von DNA-Viren als DNA-Vehikel. Derartige Viren haben den Vorteil, daß aufgrund ihrer infektiösen Eigenschaften eine sehr hohe Transfektionsrate zu erzielen ist. Die verwendeten Viren werden genetisch verändert, so daß in der transfizierten Zelle keine funktionsfähigen infektiösen Partikel gebildet werden. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahme kann jedoch aufgrund möglicher Rekombinationsereignisse ein gewisses Risiko der unkontrollierten Ausbreitung der eingebrachten gentherapeutisch wirksamen sowie viralen Gene nicht ausgeschlossen werden.Üblicherweise wird die in die Zelle eingebrachte DNA in gewissem Ausmaß in das Genom der transfizierten Zelle integriert. Einerseits kann dieses Phänomen einen erwünschten Effekt ausüben, da hierdurch eine langandauernde Wirkung der eingebrachten DNA erzielt werden kann. Andererseits bringt die Integration in das Genom ein wesentliches Risiko der Gentherapie mit sich. So kann es bspw. zu einer Insertion der eingebrachten DNA in ein intaktes Gen kommen, was eine Mutation darstellt, welche die Funktion des endogenen Gens behindert oder gar vollkommen ausschaltet. Durch solche Integrationsereignisse können einerseits für die Zelle lebenswichtige Enzymsysteme ausgeschaltet werden, andererseits besteht auch die Gefahr einer Transformation der so veränderten Zelle in einen entarteten Zustand, falls durch die Integration der Fremd-DNA ein für die Regulation des Zellwachstums entscheidendes Gen verändert wird. Daher kann bei der Verwendung von DNA-Viren als Gentherapeutika und Vakzine ein Risiko der Krebsbildung nicht ausgeschlossen werden. In diesem Zusammenhang ist auch zu beachten, daß zur wirksamen Expression der in die Zelle eingebrachten Gene die entsprechenden DNA-Vehikel einen starken Promotor, bspw. den viralen CMV-Promotor, enthalten. Die Integration derartiger Promotoren in das Genom der behandelten Zelle kann zu unerwünschten Veränderungen der Regulierung der Genexpression in der Zelle führen.Ein weiterer Nachteil der Verwendung von DNA als Gentherapeutika und Vakzine ist die Induktion pathogener Anti-DNA-Antikörper im Patienten unter Hervorrufung einer möglicherweise tödlichen Immunantwort.Im Gegensatz zu DNA ist der Einsatz von RNA als Gentherapeutikum oder Vakzin als wesentlich sicherer einzustufen. Insbesondere bringt RNA nicht die Gefahr mit sich, stabil in das Genom der transfizierten Zelle integriert zu werden. Des weiteren sind keine viralen Sequenzen, wie Promotoren, zur wirksamen Transkription, erforderlich. Darüber hinaus wird RNA wesentlich einfacherin vivoabgebaut. Wohl aufgrund der gegenüber DNA relativ kurzen Halbwertszeit von RNA im Blutkreislauf sind bisher keine anti-RNA-Antikörper nachgewiesen worden. Daher kann RNA für molekularmedizinische Therapieverfahren als Molekül der Wahl angesehen werden.Allerdings bedürfen auf RNA-Expressionssystemen beruhende medizinische Verfahren vor einer breiteren Anwendung noch der Lösung einiger grundsätzlicher Probleme. Eines der Probleme bei der Verwendung von RNA ist der schere, Zell- bzw. Gewebespezifische effiziente Transfer der Nukleinsäure. Da sich RNA in Lösung normalerweise als sehr instabil erweist, konnte durch die herkömmlichen Verfahren, die bei DNA verwendet werden, RNA bisher nicht oder nur sehr ineffizient als Therapeutikum bzw. Impfstoff verwendet werden.Für die Instabilität sind RNA-abbauende Enzyme, sog. RNAasen (Ribonucleasen), verantwortlich. Selbst kleinste Verunreinigungen von Ribonucleasen reichen aus, um RNA in Lösung vollständig abzubauen. Der natürliche Abbau von mRNA im Cytoplasma von Zellen ist sehr fein reguliert. Diesbezüglich sind mehrere Mechanismen bekannt. So ist für eine funktionale mRNA die endständige Struktur von entscheidender Bedeutung. Am 5'-Ende befindet sich die sogenannte "Cap-Struktur" (ein modifiziertes Guanosin-Nucleotid) und am 3'-Ende eine Abfolge von bis zu 200 Adenosin-Nucleotiden (der sog. Poly-A-Schwanz). Über diese Strukturen wird die RNA als mRNA erkannt und der Abbau reguliert. Darüber hinaus gibt es weitere Prozesse, die RNA stabilisieren bzw. destabilisieren. Viele diese Prozesse sind noch unbekannt, oftmals scheint jedoch eine Wechselwirkung zwischen der RNA und Proteinen dafür maßgeblich zu sein. Bspw. wurde kürzlich ein "mRNA-Surveillance-System" beschrieben (Hellerin und Parker, Annu. Rev. Genet. 1999, 33: 229 bis 260), bei dem durch bestimmte Feedback-Protein-Wechselwirkungen im Cytosol unvollständige oder Nonsense-mRNA erkannt und dem Abbau zugänglich gemacht wird, wobei ein Hauptteil dieser Prozesse durch Exonucleasen vollzogen wird.Im Stand der Technik sind einige Maßnahmen vorgeschlagen worden, um die Stabilität von RNA zu erhöhen und dadurch ihren Einsatz als Gentherapeutikum bzw. RNA-Vakzine zu ermöglichen.In diesem Zusammenhang beschreibtWO 98/34640jedoch nur synthetische DNA Moleküle, die HIV gag und Modifikationen von HIV gag kodieren. Die inWO 98/34640offenbarten Moleküle können als Polynukleotid-Vakzine eingesetzt werden, die eine effektive Immunprophylaxe gegen HIV durch Stimulierung neutralisierender Antikörper und Zellvermittelter Immunität ermöglichen.WO 98/34640beschreibt in diesem Zusammenhang jedoch keine Erhöhungen oder gar Maximierungen des G/C-Gehaltes der kodierenden synthetischen DNA Moleküle und ebenfalls keine in diesem Zusammenhang verwendeten und modifizierten mRNA-Moleküle.AuchWO 97/48370offenbart zwar synthetische DNA-Moleküle, die ein Peptid oder Protein kodieren, insbesondere HIV env als auch Modifikationen on HIV env.WO 97/48370beschreibt aber auch keinerlei Erhöhungen oder gar Maximierungen des G/C-Gehaltes der kodierenden synthetischen DNA Moleküle und ebenfalls keine Modifikationen der in diesem Zusammenhang verwendeten mRNA-Moleküle.InEP-A-1083232wird zur Lösung des vorstehend genannten Problems der Instabilität von RNAex vivoein Verfahren zur Einbringung von RNA, insbesondere mRNA, in Zellen und Organismen vorgeschlagen, bei welchem die RNA in Form eines Komplexes mit einem kationischen Peptid oder Protein vorliegt. So beschreibt dieEP 1083232auch die Verwendung derartiger Komplexe zur Behandlung von Erkrankungen, die auf mindestens einem genetischen Defekt beruhen. Hierbei wird durch die komplexierte mRNA die korrekte genetische Information bereitgestellt, die im fehlerhaften oder abwesenden Gen des Patienten nicht entsprechend vorliegt.WO 99/14346beschreibt weitere Verfahren zur Stabilisierung von mRNA. Insbesondere werden Modifizierungen der mRNA vorgeschlagen, welche die mRNA-Spezies gegenüber dem Abbau von RNasen stabilisieren. Derartige Modifikationen betreffen einerseits die Stabilisierung durch Sequenzmodifikationen, insbesondere Verminderung des C- und/oder U-Gehalts durch Baseneliminierung oder Basensubstitution. Andererseits werden chemische Modifikationen, insbesondere die Verwendung von Nucleotidanaloga, sowie 5'- und 3'- Blockierungsgruppen, eine erhöhte Länge des Poly-A-Schwanzes sowie die Komplexierung der mRNA mit stabilisierenden Mitteln und Kombinationen der genannten Maßnahmen vorgeschlagen.In den US-PatentenUS 5,580,859undUS 6,214,804werden unter anderem im Rahmen der "transienten Gentherapie" (TGT) mRNA-Vakzine und -Therapeutika offenbart. Es werden verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Translationseffizienz und der mRNA-Stabilität beschrieben, die sich vor allem auf die nicht-translatierten Sequenzbereiche beziehen.Bieler und Wagner (in:Schleef (Hrsg.), Plasmids for Therapy and Vaccination, Kapitel 9, Seiten 147 bis 168, Wiley-VCH, Weinheim, 2001) berichten von der Verwendung synthetischer Gene im Zusammenhang mit gentherapeutischen Methoden unter Verwendung von DNA-Vakzinen und lentiveralen Vektoren. Es wird die Konstruktion eines synthetischen, von HIV-1 abgeleitetengag-Gens beschrieben, bei welchem die Codons gegenüber der Wildtyp-Sequenz derart modifiziert wurden (alternative Codonverwendung, engl. "codonusage"), daß sie der Verwendung von Codons entsprach, die in hoch exprimiertenSäugergenen zu finden ist. Dadurch wurde insbesondere der A/T-Gehalt gegenüber der Wildtyp-Sequenz vermindert. Die Autoren stellen insbesondere eine erhöhte Expressionsrate des synthetischengag-Gens in transfizierten Zellen fest. Des weiteren wurde in Mäusen eine erhöhte Antikörperbildung gegen dasgag-Protein bei mit dem synthetischen DNA-Konstrukt immunisierten Mäusen und auch eine verstärkte Cytokinfreisetzungin vitrobei transfizierten Milzzellen von Mäusen beobachtet. Schließlich konnte eine Induzierung einer cytotoxischen Immunantwort in mit demgag-Expressionsplasmid immunisierten Mäusen festgestellt werden. Die Autoren dieses Artikels führen die verbesserten Eigenschaften ihres DNA-Vakzins im wesentlichen auf einen durch die optimierte Codonverwendung hervorgerufene Veränderung des nucleo-cytoplasmatischen Transports der vom DNA-Vakzin exprimierten mRNA zurück. Im Gegensatz dazu halten die Autoren die Auswirkung der veränderten Codonverwendung auf die Translationseffizienz für gering.Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein neues System zur Gentherapie bereitzustellen, das die mit den Eigenschaften von DNA-Therapeutika verbundenen Nachteile überwindet und die Wirksamkeit von auf RNA-Spezies basierenden Therapeutika erhöht.Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.Insbesondere wird erfindungsgemäß eine modifizierte mRNA sowie mindestens eine derartige modifizierte mRNA in Verbindung mit einem pharmazeutisch, auch zur Herstellung eines Medikaments zur Gentherapie, verträglichen Träger und/oder Vehikel enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die modifizierte mRNA für mindestens ein biologisch wirksames Peptid oder Polypeptid codiert, welches in dem zu behandelnden Patienten nicht nur unzureichend oder fehlerhalft gebildet wird, wobei die Sequenz der mRNA, insbesondere im für das mindestens eine Peptid oder Polypeptid codierenden Bereich, gegenüber der Wildtyp-mRNA folgende Modifikation aufweist.Der G/C-Gehalt des für das Peptid oder Polypeptid codierenden Bereichs der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA ist größer als der G/C-Gehalt des codierenden Bereichs der für das Peptidoder Polypeptid codierenden Wildtyp-mRNA, wobei die codierte Aminosäuresequenz gegenüber dem Wildtyp unverändert ist.Diese Modifikation beruht auf der Tatsache, daß für eine effiziente Translation einer mRNA die Sequenzabfolge des zu translatierenden Bereichs der mRNA wesentlich ist. Dabei spielt die Zusammensetzung und die Abfolge der verschiedenen Nucleotide eine große Rolle. Insbesondere sind Sequenzen mit erhöhtem G(Guanosin)/C(Cytosin)-Gehalt stabiler als Sequenzen mit einem erhöhten A(Adenosin)/U(Uracil)-Gehalt. Daher werden erfindungsgemäß unter Beibehaltung der translatierten Aminosäureabfolge die Codons gegenüber der Wildtyp-mRNA derart variiert, daß sie vermehrt G/C-Nucleotide beinhalten. Da mehrere Codons für ein und dieselbe Aminosäure codieren (Degeneration des genetischen Codes), können die für die Stabilität günstigsten Codons ermittelt werden (alternative Codonverwendung, engl. "codon usage").In Abhängigkeit von der durch die modifizierte erfindungsgemäße mRNA zu codierenden Aminosäure sind unterschiedliche Möglichkeiten zur Modifikation der mRNA-Sequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz möglich. Im Fall von Aminosäuren, die durch Codons codiert werden, die ausschließlich G- oder C- Nucleotide enthalten, ist keine Modifikation des Codons erforderlich. So erfordern die Codons für Pro (CCC oder CCG), Arg (CGC oder CGG), Ala (GCC oder GCG) und Gly (GGC oder GGG) keine Veränderung, da kein A oder U vorhanden ist.In folgenden Fällen werden die Codons, welche A-und/oder U-Nucleotide enthalten durch Substituieren anderer Codons, welche die gleichen Aminosäuren codieren, jedoch kein A und/oder U enthalten, verändert. Beispiele sind:Die Codons für Pro können von CCU oder CCA zu CCC oder CCG verändert werden;die Codons für Arg können von CGU oder CGA oder AGA oder AGG zu CGC oder CGG verändert werden;die Codons für Ala können von GCU oder GCA zu GCC oder GCG verändert werden;die Codons für Gly können von GGU oder GGA zu GGC oder GGG verändert werden.In anderen Fällen können A bzw. U-Nucleotide zwar nicht aus den Codons eliminiert werden, es ist jedoch möglich, den A- und U-Gehalt durch Verwendung von Codons zu vermindern, die weniger A- und/oder U-Nucleotide enthalten. Zum Beispiel:Die Codons für Phe können von UUU zu UUC verändert werden;die Codons für Leu können von UUA, CUU oder CUA zu CUC oder CUG verändert werden;die Codons für Ser können von UCU oder UCA oder AGU zu UCC, UCG oder AGC verändert werden;das Codon für Tyr kann von UAU zu UAC verändert werden;das Stop-Codon UAA kann zu UAG oder UGA verändert werden;das Codon für Cys kann von UGU zu UGC verändert werden;das Codon His kann von CAU zu CAC verändert werden;das Codon für Gln kann von CAA zu CAG verändert werden;die Codons für Ile können von AUU oder AUA zu AUC verändert werden;die Codons für Thr können von ACU oder ACA zu ACC oder ACG verändert werden;das Codon für Asn kann von AAU zu AAC verändert werden;das Codon für Lys kann von AAA zu AAG verändert werden;die Codons für Val können von GUU oder GUA zu GUC oder GUG verändert werden;das Codon für Asp kann von GAU zu GAC verändert werden;das Codon für Glu kann von GAA zu GAG verändert werden.Im Falle der Codons für Met (AUG) und Trp (UGG) besteht hingegen keine Möglichkeit der Sequenzmodifikation.Die vorstehend aufgeführten Substitutionen können selbstverständlich einzeln aber auch in allen möglichen Kombinationen zur Erhöhung des G/C-Gehalts der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA gegenüber der ursprünglichen Sequenz verwendet werden. So können beispielsweise alle in der ursprünglichen (Wildtyp-) Sequenz auftretenden Codons für Thr zu ACC (oder ACG) verändert werden. Vorzugsweise werden jedoch Kombinationen der vorstehenden Substitutionsmöglichkeiten genutzt, z.B.:Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Thr codierenden Codons zu ACC (oder ACG) und Substitution aller ursprünglich für Ser codierenden Codons zu UCC ( oder UCG oder AGC);Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Ile codierenden Codons zu AUC und Substitution aller ursprünglich für Lys codierenden Codons zu AAG und Substitution aller ursprünglich für Tyr codierenden Codons zu UAC;Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val codierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu codierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala codierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Arg codierenden Codons zu CGC (oder CGG);Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val codierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller ursprünglich für Glu codierenden Codons zu GAG und Substitution aller ursprünglich für Ala codierenden Codons zu GCC (oder GCG) und Substitution aller ursprünglich für Gly codierenden Codons zu GGC (oder GGG) und Substituion aller ursprünglich für Asn codierenden Codons zu AAC;Substitution aller in der ursprünglichen Sequenz für Val codierenden Codons zu GUC (oder GUG) und Substitution aller usprünglich für Phe codierenden Codons zu UUC und Substitution aller ursprünglich für Cys codierenden Codons zu UGC und Substitution aller ursprünglich für Leu codierenden Codons zu CUG (oder CUC) und Substitution aller ursprünglich für Gln codierenden Codons zu CAG und Substitution aller ursprünglich für Pro codierenden Codons zu CCC (oder CCG);usw.Vorzugsweise wird der G/C-Gehalt des für das Peptid bzw. Polypeptid codierenden Bereichs der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA um mindestens 7%-Punkte, mehr bevorzugt um mindestens 15%-Punkte, besonders bevorzugt um mindestens 20%-Punkte gegenüber dem G/C-Gehalt des codierten Bereichs der für das Polypeptid codierenden Wildtyp-mRNA erhöht.Besonders bevorzugt ist es in diesem Zusammenhang, den G/C-Gehalt der modifizierten mRNA insbesondere zur Verwendung zur Herstellung eines Medikaments, insbesondere im für das mindestens eine Peptid bzw. Polypeptid codierenden Bereich, im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz maximal zu erhöhen.Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist es, den erfindungsgemäß in der modifizierten mRNA erhöhten, insbesondere maximalen, sequenziellen G/C-Anteil mit den "häufigen" Codons zu verknüpfen, ohne die Aminosäuresequenz des durch den codierenden Bereich der mRNA codierten Peptids bzw. Polypeptids (ein oder mehrere) zu verändern. Diesebevorzugte Ausführungsform stellt eine besonders effizient translatierte und stabilisierte mRNA bspw. für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung bereit.In den Sequenzen eukaryotischer mRNAs gibt es destabilisierende Sequenzelemente (DSE), an welche Signalproteine binden und den enzymatischen Abbau der mRNAin vivoregulieren. Daher werden zur weiteren Stabilisierung der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen modifizierten mRNA gegebenenfalls im für das mindestens eine Peptid bzw. Polypeptid codierenden Bereich ein oder mehrere Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Bereich der Wildtyp-mRNA vorgenommen, so daß keine destabilisierenden Sequenzelemente enthalten sind. Selbstverständlich ist es ebenfalls bevorzugt, gegebenenfalls in den nicht-translatierten Bereichen (3'- und/oder 5'-UTR) vorhandene DSE aus der erfindungsgemäßen mRNA zu eliminieren.Derartige destabilisierende Sequenzen sind bspw. AU-reiche Sequenzen ("AURES"), die in 3'-UTR-Abschnitten zahlreicher instabiler mRNA vorkommen (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 bis 1674). Die in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen erfindungsgemäßen RNA-Moleküle sind daher vorzugsweise derart gegenüber der Wildtyp-mRNA verändert, daß sie keine derartigen destabilisierenden Sequenzen aufweisen. Dies gilt auch für solche Sequenzmotive, die von möglichen Endonucleasen erkannt werden, bspw. die Sequenz GAACAAG, die im 3' UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor codierenden Gens enthalten ist (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 bis 1980). Auch diese Sequenzmotive werden bevorzugt in der modifizierten mRNA der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eliminiert.Einem Fachmann sind verschiedene Verfahren geläufig, die zur Substitution von Codons in der erfindungsgemäßen modifizierten mRNA geeignet sind. Im Falle kürzerer codierender Bereiche (die für biologisch wirksame Peptide codieren) kann bspw. die gesamte mRNA chemisch unter Verwendung von Standardtechniken synthetisiert werden.Bevorzugt werden allerdings Basensubstitutionen unter Verwendung einer DNA-Matrize zur Herstellung der modifizierten mRNA mit Hilfe von Techniken der gängigen zielgerichtetenMutagenese eingeführt;Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. Aufl., Cold Spring Harbor, NY, 2001.Bei diesem Verfahren wird zur Herstellung der erfindungsgemäßen mRNA daher ein entsprechendes DNA-Molekülin vitrotranskribiert. Diese DNA-Matrize besitzt einen geeigneten Promotor, bspw. einen T7 -oder SP6-Promotor, für diein vitroTranskription, dem die gewünschte Nucleotidsequenz für die herzustellende mRNA und ein Termisationssignal für die inin vitroTranskribtion folgen. Das DNA-Molekül, das die Matrize des herzustellenden RNA-Konstrukts bildet, kann durch fermentative Vermehrung und anschließende Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids hergestellt werden. Als für die vorliegende Erfindung geeignete Plasmide können bspw. die Plasmide pT7Ts (GenBank-Zugriffsnummer U26404;Lai et al., Development 1995, 121: 2349 bis 2360), pGEM®-Reihe, bspw. pGEM®-1 (GenBank-Zugriffsnummer X65300; von Promega) und pSP64 (GenBank-Zugriffsnummer X65327) genannt werden; vgl. auchMezei und Storts, Purification of PCR Products, in: Griffin und Griffin (Hrsg.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.Es kann so unter Verwendung kurzer synthetischer DNA-Oligonucleotide, die an den entstehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Übergänge aufweisen, oder durch chemische Synthese hergestellte Gene die gewünschte Nucleotidsequenz nach einem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden in ein geeignetes Plasmid cloniert werden (vgl. Maniatis et al., s.o.). Das DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in welchem es in einfacher oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten.Die erfindungsgemäß modifizierte mRNA, welche in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, und zur Herstellung eines Medikaments zur Gentherapie verwendet wird, kann darüber hinaus eine 5'-Cap-Struktur (ein modifiziertes Guanosin-Nucleotid) aufweisen. Als Beispiele von Cap-Strukturen können m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A und G(5')ppp(5')G genannt werden.Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die erfindungsgemäß modifizierte mRNA einen PolyA-Schwanz von mindestens 50 Nuclotiden, vorzugsweisemindestens 70 Nucleotiden, mehr bevorzugt mindestens 100 Nucleotiden, besonders bevorzugt mindestens 200 Nucleotiden.Für eine effiziente Translation der erfindungsgemäßen mRNA ist weiterhin eine wirksame Bindung der Ribosomen an die Ribosomen-Bindungsstelle (Kozak-Sequenz: GCCGCCACCAUGG, das AUG bildet das Startcodon) erforderlich. Diesbezüglich ist festgestellt worden, daß ein erhöhter A/U-Gehalt um diese Stelle herum eine effizientere Ribosomen-Bindung an die mRNA ermöglicht.Des weiteren ist es möglich, in die modifizierte und erfindungsgemäß mRNA eine oder mehrere sog. IRES (engl. "internal ribosomal entry side) einzufügen. Eine IRES kann so als alleinige Ribosomen-Bindungsstelle fungieren, sie kann jedoch auch zur Bereitstellung einer mRNA dienen, die mehrere Peptide bzw. Polypeptide codiert, die unabhängig voneinander durch die Ribosomen translatiert werden sollen ("multicistronische mRNA"). Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer IRES-Sequenzen sind diejenigen aus Picomaviren (z.B. FMDV), Pestviren (CFFV), Polioviren (PV), Enzephalo-Myocarditis-Viren (ECMV), Maul-und-Klauenseuche-Viren (FMDV), Hepatitis-C-Viren (HCV), Klassisches-Schweinefieber-Viren (CSFV), Murines-Leukoma-Virus (MLV), Simean-Immundefizienz-Viren (SIV) oder Cricket-Paralysis-Viren (CrPV).Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die modifizierte erfindungsgemäße mRNA in den 5'- und/oder 3'-nicht translatierten Bereichen Stabilisierungssequenzen auf, die befähigt sind, die Halbwertszeit der mRNA im Cytosol zu erhöhen.Diese Stabilisierungssequenzen können eine 100%ige Sequenzhomologie zu natürlich vorkommenden Sequenzen, die in Viren, Bakterien und Eukaryoten auftreten, aufweisen, können aber auch teilweise oder vollständig synthetischer Natur sein. Als Beispiel für stabilisierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können die nicht-translatierten Sequenzen (UTR) des β-Globingens, bspw. vonHomo sapiensoderXenopus laevis, genannt werden. Ein anderes Beispiel einer Stabilisierungssequenz weist die allgemeine Formel (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC auf, die im 3'UTR dersehr stabilen mRNA enthalten ist, die für α-Globin, α-(I)-Collagen, 15-Lipoxygenase oder für Tyrosin-Hydroxylase codiert (vgl.Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 bis 2414). Selbstverständlich können derartige Stabilisierungssequenzen einzeln oder in Kombination miteinander als auch in Kombination mit anderen, einem Fachmann bekannten Stabilisierungssequenzen verwendet werden.Zur weiteren Stabilisierung der modifizierten und erfindungsgemäß mRNA ist es außerdem bevorzugt, daß diese mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nucleotide aufweist. Dies beruht auf der Tatsache, daß die in den Zellen vorkommenden RNA-abbauenden Enzyme als Substrat vorzugsweise natürlich vorkommende Nucleotide erkennen. Durch Einfügen von Nucleotidanaloga kann daher der RNA-Abbau erschwert werden, wobei die Auswirkung auf die Translationseffizienz bei Einfügen von diesen Analoga, insbesondere in den codierenden Bereich der mRNA, einen positiven oder negativen Effekt auf die Translationseffizienz haben kann.In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nucleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioate, Peptidnucleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguaonsin, 5-Methylcytosin und Inosin genannt werden. Die Herstellung derartiger Analoga sind einem Fachmann bspw. aus denUS-Patenten 4,373,071,US 4,401,796,US 4,415,732,US 4,458,066,US 4,500,707,US 4,668,777,US 4,973,679,US 5,047,524,US 5,132,418,US 5,153,319,US 5,262,530und5,700,642bekannt. Erfindungsgemäß können derartige Analoga in nicht-translatierten und translatierten Bereichen der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA vorkommen.Des weiteren kann der wirksame Transfer der modifizierten und erfindungsgemäß mRNA in die zu behandelnden Zellen bzw. den zu behandelnden Organismus dadurch verbessert werden, daß die modifizierte mRNA mit einem kationischen Peptid oder Protein assoziiert oder daran gebunden ist. Insbesondere ist dabei die Verwendung von Protamin als polykationischem, Nucleinsäure-bindenden Protein besonders wirksam. Des weiteren ist die Verwendung anderer kationischer Peptide oder Proteine, wie Poly-L-Lysin oder Histonen, ebenfalls möglich. Diese Vorgehensweise zur Stabilisierung der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA ist inEP-A-1083232beschrieben.Bei der gentherapeutischen Verwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung (bzw. bei der Verwendung der mRNA zur Gentherapie bzw. bei der Verwendung der mRNA zur Herstelllung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Gentherapie) codiert die modifizierte mRNA für mindestens ein biologisch wirksames Peptid oder Polypeptid, welches in dem zu behandelnden Patienten bspw. nicht, nur unzureichend oder fehlerhaft gebildet wird. Daher sind Beispiele von der erfindungsgemäßen mRNA codierte Polypeptide Dystrophin, der Chloridkanal, der bei der cystischen Fibrose fehlerhaft verändert ist, Enzyme, die bei metabolischen Erkrankungen, wie Phenylketonurie, Galktosämie, Homocystinurie, Adenosindeaminasedefizienz usw., fehlen bzw. fehlerhaft sind, Enzyme, die an der Synthese von Neurotransmittern, wie Dopamin, Norepinephrin und GABA beteiligt sind, insbesondere Tyrosinhydroxylase und DOPA-Decarboxylase, α-1-Antitrypsin usw. Des weiteren kann die pharmazeutische Zusammensetzung zur Abgabe von Zelloberflächenrezeptoren und Molekülen, die an derartige Rezeptoren binden, verwendet werden, indem die in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltene modifizierte mRNA für ein derartiges biologisch wirksames Protein bzw. Peptid codiert. Beispiele derartiger Proteine, die extrazellulär wirken oder an Zelloberflächenrezeptoren binden, sind bspw. Gewebsplasminogenaktivator (TPA), Wachstumshormone, Insulin, Interferone, Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulisierungsfaktor (GM-CFS), Erythropoietin (EPO) usw. Durch Auswahl geeigneter Wachstumsfaktoren kann die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bspw. zur Geweberegeneration verwendet werden. Dadurch können Erkrankungen, die durch eine Gewebedegeneration gekennzeichnet sind, bspw. neurodegenerative Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson usw., und andere degenerative Erkrankungen, bspw. Arthrose, behandelt werden. In diesen Fällen codiert die, insbesondere in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthaltene, modifizierte mRNA vorzugsweise für Wachstumsfaktoren aus der TGF-β -Familie, wobei insbesondere EGF, FGF, PDGF, BMP, GDNF, BDNF, GDF und neurotrophe Faktoren, wie NGF, Neutrophine usw. zu nennen sind.Darüber hinaus kann die erfindungsgemäß modifizierte mRNA neben dem gentherapeutisch wirksamen Peptid bzw. Polypeptid auch mindestens einen weiteren funktionalen Abschnitt enthalten, der bspw. für ein die Immunantwort förderndes Cytokin (Monokin, Lymphokin, Interleukin oder Chemokin, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, INF-α, INF-γ, GM-CFS, LT-α oder Wachstumsfaktoren, wie hGH, codiert.Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält neben der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel. Entsprechende Wege zur geeigneten Formulierung und Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung sind bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das vollinhaltlich Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung kommen als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hydrogenierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolymere in Betracht. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen können Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung,wie z.B. Polylactat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthalten. Die jeweiligen Ausführungsformen der Zusammensetzungen werden abhängig vom physikalische Verhalten, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, die Stabilität, Bioverfügbarkeit oder Abbaubarkeit gewählt. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Substanzen oder Zusammensetzungen, enthaltend solche Substanzen, nämlich Beschichtungen mit Polymeren offenbart (z.B. Poloxamere oder Poloxamine). Weiterhin können erfindungsgemäßen Substanzen bzw. Zusammensetzungen protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibitoren oder Permeabilitätsverstärker, aufweisen. Bevorzugte Träger sind typischerweise wässrige Trägermaterialien, wobei Wasser zur Injektion (WFI) oder Wasser, gepuffert mit Phosphat, Citrat oder Acetat usw. verwendet wird, und der pH typischerweise auf 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eingestellt wird. Der Träger bzw. das Vehikel - wird zusätzlich vorzugsweise Salzbestandteile enthalten, z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder andere Komponenten, welche die Lösung bspw. isotonisch machen. Weiterhin kann der Träger bzw. das Vehikel neben den vorstehend genannten Bestandteilen zusätzliche Komponenten, wie humanes Serumalbumin (HSA), Polysorbat 80, Zucker oder Aminosäuren, enthalten.Die Art und Weise der Verabreichung und die Dosierung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung hängen von der zu behandelnden Erkrankung und deren Fortschrittsstadium, wie auch dem Körpergewicht, dem Alter und dem Geschlecht des Patienten ab.Die Konzentration der modifizierten erfindungsgemäßen mRNA in derartigen Formulierungen kann daher innerhalb eines weiten Bereichs von 1 µg bis 100 mg/ml variieren. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise parenteral, bspw. intravenös, intraarteriell, subkutan, intramuskulär, dem Patienten verabreicht. Ebenso ist es möglich, die pharmazeutische Zusammensetzung topisch oder oral zu verabreichen.Somit kann erfindungsgemäß auch ein Verfahren zur Behandlung der vorstehend genannten Krankheiten eingesetzt werden, welches das Verabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, insbesondere einen Menschen, umfasst.Darüber hinaus kann ebenfalls ein Verfahren eingesetzt werden, das der Ermittlung der modifizierten Sequenz der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen mRNA dient. Dabei kann bspw. die Adaptierung der RNA-Sequenzen mit zwei unterschiedlichen Optimierungszielen durchgeführt werden. Zum einen mit größtmöglichen G/C-Gehalt, zum anderen ggf. unter bestmöglicher Berücksichtigung der Häufigkeit der tRNAs gemäß Codon Usage. Im ersten Schritt des Verfahrens wird eine virtuelle Translation einer beliebigen RNA(oder DNA)-Sequenz durchgeführt, um die entsprechende Aminosäuresequenz zu generieren. Ausgehend von der Aminosäuresequenz wird eine virtuelle reverse Translation durchgeführt, die aufgrund des degenerierten genetischen Codes Wahlmöglichkeiten für die entsprechenden Codons liefert. Je nach geforderter Optimierung bzw. Modifizierung werden zur Auswahl der geeigneten Codons entsprechende Selektionslisten und Optimierungsalgorithmen verwendet. Die Ausführung der Algorithmen erfolgt typischerweise mit Hilfe einer geeigneten Software auf einem Computer. So wird die optimierte mRNA-Sequenz erstellt und kann bspw. mit Hilfe einer entsprechenden Anzeigevorrichtung ausgegeben und mit der usrpünglichen (Wildtyp-)Sequenz verglichen werden. Das gleiche gilt auch für die Häufigkeit der einzelnen Nucleotide. Die Änderungen gegenüber der ursprünglichen Nucleotidsequenz werden dabei vorzugsweise hervorgehoben. Weiter werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in der Natur bekannte stabile Sequenzen eingelesen, welche die Grundlage für eine gemäß natürlichen Sequenzmotiven stabilisierte RNA bieten können. Es kann ebenfalls eine Sekundärstrukturanalyse vorgesehen werden, die anhand von Strukturberechnungen stabilisierende und instabilisierende Eigenschaften bzw. Bereiche der RNA analysieren kann.Die Figuren zeigen:Fig. 1zeigt Wildtyp- und modifizierte nicht-erfindungsgemäße Sequenzen für das Influenza-Matrix-Protein.Fig. 1Azeigt das Wildtyp-Gen undFig. 1Bzeigt die davon abgeleitete Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code).Fig. 1Czeigt eine für das Influenza-Matrix-Protein codierende Gen-Sequenz, deren G/C-Gehalt gegenüber der Wildtyp-Sequenz erhöht ist.Fig. 1Dzeigt die Sequenz eines Gens, das für eine sekretierte Form des Influenza-Matrix-Proteins codiert (einschließlich einer N-terminalen Signalsequenz), wobei der G/C-Gehalt der Sequenz gegenüber der Wildtyp-Sequenz erhöht ist.Fig. 1Ezeigt eine für das Influenza-Matrix-Protein codierende mRNA, die im Vergleich zur Wildtyp-mRNA stabilisierende Sequenzen enthält.Fig. 1Fzeigt eine für das Influenza-Matrix-Protein codierende nicht-erfindungsgemäße mRNA, die neben stabilisierenden Sequenzen einen erhöhten G/C-Gehalt aufweist.Fig. 1Gzeigt ebenfalls eine modifizierte nicht-erfindungsgemäße mRNA, die für die sekretierte Form des Influenza-Matrix-Proteins codiert und im Vergleich zum Wildtyp stabilisierende Sequenzen und einen erhöhten GC-Gehalt aufweist. InFig. 1AundFig. 1C bis 1Gsind die Start- und Stop-Codons fett hervorgehoben. Gegenüber der Wildtyp-Sequenz vonFig. 1Averänderte Nucleotide sind in denFiguren 1C bis 1Gin Großbuchstaben dargestellt.Fig. 2zeigt Wildtyp- und modifizierte nicht-erfindungsgemäße Sequenzen, die für das Tumorantigen MAGE1 codieren.Fig. 2Azeigt die Sequenz des Wildtyp-Gens undFig. 2Bdie davon abgeleitete Aminosäuresequenz (Drei-Buchstaben-Code)Fig. 2Czeigt eine für MAGE1 codierende modifizierte nicht-erfindungsgemäße mRNA, deren G/C-Gehalt gegenüber dem Wildtyp erhöht ist.Fig. 2Dzeigt die Sequenz einer für MAGE1 codierenden modifizierten nicht-erfindungsgemäßen mRNA, bei der die Codon-Verwendung bezüglich der Codierung möglichst häufig in de Zelle vorkommender tRNA optimiert wurde. Start- und Stop-Codons sind jeweils fett gekennzeichnet.Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung näher, ohne sie einzuschränken.Beispiel 1Als beispielhafte Ausführungsform des Verfahrens zu Ermittlung der Sequenz einer erfindungsgemäß modifizierten mRNA wurde ein Computerprogramm erstellt, das mit Hilfe des genetischen Codes bzw. dessen degenerativer Natur die Nucleotid-Sequenz einer beliebigenmRNA derart modifiziert, daß sich ein maximaler G/C-Gehalt in Verbindung mit der Verwendung von Codons, die für möglichst häufig in der Zelle vorkommende tRNAs codieren, ergibt, wobei die durch die modifizierte mRNA codierte Aminosäure-Sequenz gegenüber der nicht-modifizierten Sequenz identisch ist. Alternativ kann auch nur der G/C-Gehalt oder nur die Codonverwendung gegenüber der ursprünglichen Sequenz modifiziert werden.Der Quellcode in Visual Basic 6.0 (eingesetzte Entwicklungsumgebung: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 mit Servicepack 3) ist im Anhang angegeben.Beispiel 2Mit Hilfe des Computerprogramms von Beispiel 1 wurde ein RNA-Konstrukt mit einer hinsichtlich Stabilisierung und Translationseffizienz optimierten Sequenz des lac-Z-Gens ausE.colierstellt. Es konnte so ein G/C-Gehalt von 69% (im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz von 51%; vgl.Kalnins et al., EMBO J. 1983, 2(4): 593-597) erzielt werden. Durch die Synthese überlappender Oligonucleotide, welche die modifizierte Sequenz aufweisen, wurde die optimierte Sequenz gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren hergestellt. Die endständigen Oligonucleotide wiesen die folgenden Restriktionsschnittstellen auf: Am 5'-Ende eineEcoRV- sowie am 3'-Ende eineBglII-Schnittstelle. Über Verdau mitEcoRV/BglII wurde die modifizierte lacZ-Sequenz in das Plasmid pT7Ts (GenBank-Zugriffsnummer U 26404; vgl. Lai et al., s.o.). pT7Ts enthält als nichttranslatierte Regionen Sequenzen aus dem β-Globingen vonXenopus levisjeweils an 5' und 3'. Das Plasmid wurde vor dem Einfügen der modifizierten lacZ-Sequenz mit den genannten Restriktionsenzymen geschnitten.Das pT7Ts-lac-Z-Konstrukt wurde in Bakterien vermehrt und durch Phenol-Chloroform-Extraktion gereinigt. 2 µg des Konstrukts wurdenin vitromittels dem einem Fachmann bekannten Verfahren transkribiert, wodurch die modifizierte mRNA hergestellt wurde.Beispiel 3Mit Hilfe des Computerprogramms von Beispiel 1 wurde das Gen für das Influenza-Matrix-Protein (Wildtyp-Sequenz vgl.Fig. 1A, abgeleitete AminosäuresequenzFig. 1B) optimiert. Dadurch wurde die inFig. 1Cdargestellte G/C-reiche Sequenzvariante erstellt. Ebenfalls wurde eine für die sekretierte Form des Influenza-Matrix-Proteins codierende G/C-reiche Sequenz, die für eine N-terminale Signalsequenz codiert, ermittelt (vgl.Fig. 1D). Die sekretierte Form des Influenza-Matrix-Proteins hat den Vorteil, daß sie eine im Vergleich zur nicht-sekretierten Form erhöhte Immunogenizität aufweist.Ausgehend von den optimierten Sequenzen wurden entsprechende nicht-erfindungsgemäße mRNA-Moleküle entworfen. Die hinsichtlich G/C-Gehalt und Codonverwendung optimierte mRNA für das Influenza-Matrix-Protein wurde zusätzlich mit stabilisierenden Sequenzen im 5'- und 3'-Bereich (die Stabilisierungssequenzen stammen aus den 5'- bzw. 3'-UTRs des β-Globin-mRNA vonXenupus laevis; vgl. pT7Ts-Vektor in Lai et al., s.o.) ausgestattet (vgl.Fig. 1E und 1F). Desgleichen wurde auch die für die sekretierte Form des Influenza-Matrix-Proteins codierende mRNA im translatierten Bereich sequenzoptimiert und mit den genannten stabilisierenden Sequenzenversehen (vgl.Fig. 1G).Beispiel 4Mit Hilfe des Computerprogramms von Beispiel 1 wurde die für das Tumorantigen MA-GE1 codierende mRNA modifiziert. Dadurch wurde die inFig. 2Cgezeigte Sequenz ermittelt, die im Vergleich zur Wildtyp-Sequenz (275 G, 244 G) einen um 24% höheren G/C-Gehalt aufweist (351 G, 291 C). Des weiteren wurde die Wildtyp-Sequenz durch alternative Codonverwendung hinsichtlich der Translationseffizienz aufgrund der Codierung von in der Zelle häufiger vorkommenden tRNAs verbessert (vgl.Fig. 2D). Durch die alternative Codonverwendung wurde der G/C-Gehalt ebenfalls um 24% erhöht.Anhang: Quelltext eines erfindungsgemäßen ComputerprogrammsSEQUENCE LISTING<110> CureVac GmbH<120> Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine stabilisierte und für die Translation in ihren codierenden Bereichen optimierte mRNA<130> CU01P003WOEPT2<150>PCT/EP02/06180<151> 2002-06-05<160> 13<170> PatentIn Ver. 2.1<210> 1<211> 774<212> DNA<213> Influenza virus<220><223> Influenza-Matrix: Wildtyp-Gen (zum Vergleich)<220><223> Startcodon: atg (Nucleotide 11 bis 13), Stopcodon: tga (Nucleotide 767 bis 769 )<400> 1<210> 2<211> 252<212> PRT<213> Influenza virus<400> 2<210> 3<211> 775<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Influenza-Matrix: Gen mit erhöhtem G/C-Gehalt<220><223> Startcodon: atg (Nucleotide 11 bis 13), Stopcodon: tga (Nucleotide 767 bis 769)<400> 3<210> 4<211> 844<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Influenza-Matrix: Gen für sekretierte Form (mit N-terminaler Signalsequenz) mit erhöhtem G/C-Gehalt<220><223> Startcodon: atg (Nucleotide 11 bis 13), Stopcodon: tga (Nucleotide 836 bis 838)<400> 4<210> 5<211> 942<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Influenza-Matrix: mRNA mit Stabilisierungssequenzen<220><223> Die Stabilisierungssequenzen stammen aus den 5'- bzw. 3'-UTRs der β-Globin-mRNA von Xenopus laevis<220><223> Startcodon: aug (Nucleotide 56 bis 58), Stopcodon: uga (Nucleotide 812 bis 814)<400> 5<210> 6<211> 942<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Influenza-Matrix: mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und Stabilisierungssequenzen<220><223> Die Stabilisierungssequenzen stammen aus den 5'- bzw. 3'-UTRs der β-Globin-mRNA von Xenopus laevis<220><223> Startcodon: aug (Nucleotide 56 bis 58), Stopcodon: uga (Nucleotide 812 bis 814)<400> 6<210> 7<211> 1011<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Influenza-Matrix: für sekretierte Form codierende mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt und Stabilisierungssequenzen<220><223> Startcodon: aug (Nucleotide 56 bis 58), Stopcodon: uga (Nucleotide 881 bis 883)<400> 7<210> 8<211> 940<212> DNA<213> Homo sapiens<220><223> MAGE1: Wildtyp-Gen (zum Vergleich)<220><223> Startcodon: atg (Nucleotide 5 bis 7), Stopcodon: tga (Nucleotide 932 bis 934)<400> 8<210> 9<211> 308<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> Tumorantigen MAGE1: Proteinsequenz<400> 9<210> 10<211> 939<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: MAGE1: mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt<220><223> Startcodon: aug (Nucleotide 1 bis 3), Stopcodon: uga (Nucleotide 937 bis 939)<400> 10<210> 11<211> 939<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: MAGE1: mRNA mit alternativer Codonverwendung<220><223> Startcodon: aug (Nucleotide 1 bis 3), Stopcodon: uga (Nucleotide 937 bis 939)<400> 11<210> 12<211> 7<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Ein für eine Endonuklease erkennbares Sequenzmotiv, das im 3'UTR-Segment des für den Transferin-Rezeptor codierenden Gens enthalten ist (S. 10 der Beschreibung).<400> 12gaacaag 7<210> 13<211> 13<212> RNA<213> Artificial Sequence<220><223> Description of Artificial Sequence: Kozak-Sequenz, Ribosomen-Bindungsstelle (S. 12 der Beschreibung)<400> 13gccgccacca ugg 13 See more